雙向電泳的樣品的制備

樣品制備是雙向電泳中Z關鍵的一步，將直接影響 2-DE 結果好壞。目前并 沒有一個通用的樣品制備方法，盡管處理方法多種多樣，但都遵循幾個基本的原則：
1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽提Zda量的總蛋白，減少蛋白質的損失；
2）減少對蛋白質的人為修飾；3）破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作 用，并使蛋白質處于完全變性狀態。

根據這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(超tropes), 主要包 括尿素（Urea）和硫脲（thiourea ）；表面活性劑（sufactants），也稱去垢劑，如 CHAPS與 Zwittergent系列等雙性離子去垢劑；還原劑（reducingagents），

Z常用的是二硫蘇糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP ）等。當然，也可以選擇性的加入 Tris-base, 蛋白酶YZ劑以及核酸酶。 樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理組合，以達到對樣品蛋白的Zda抽提。在對樣品蛋白質提取的過程中，必須考慮到去除影響蛋白質可溶性和 2DE 重復性的物質，比如核酸、脂、多糖等大分子以及鹽 類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過高會降低等電聚焦的電壓，甚至會損壞 IPG 膠條，這樣都會造成 2-DE 的失敗。樣品制備的失敗很難通過后續工作的完善或改進獲得補償。核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應控制好條件，并防止產生泡沫；而加入的外源核酸酶則會出現在Z終的 2D 膠上。脂類和多糖都可以通過 超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時間太長；也可以采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會造成蛋白質的部分損失。 因此，樣品制備方法必須根據不同的樣品、所處的狀態以及實驗目的和要求來進行選擇。目前有很多方法適于 2-DE，如組織或細胞的總蛋白提取物、亞細 胞組份或細胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亞組份蛋白（如磷酸化蛋白、采用親合純化凝集素結合蛋白等）。

一、細胞樣品

1. 細胞培養，加藥與處理。

2. 胰酶消化貼壁細胞，PBS 漂洗 3 次(1500 ｇ，5min) ，棄上清,再次離心，去 盡殘液（非 常 重 要 ！）。如要比較細胞膜蛋白組的差別，**用細胞刮收獲細 胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS，可有效降低樣品的

鹽濃度。

加入 5 倍體積裂解液，混勻（或將 1×106 細胞懸于 60～100 l 裂 解 液 中 ）。

3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ，在 4℃放置 15 分鐘。

4. 15,000轉，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉，4℃離心 30 分 鐘 ）。

5. 收集上清。

6. 測定蛋白濃度(采用 BioRad RC/DC protein assaykit)。

7. 分裝樣品，凍存于－70℃。

二、組織樣品

1. 碾缽碾磨組織，碾至粉末狀。

2. 將適量粉末狀組織轉移至勻漿器，加入適量裂解液，進行勻漿。

3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在 4℃放置 15 分鐘。

4. 15,000 轉，4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉，4℃離心 30 分 鐘 ）。

5. 收集上清，測定蛋白濃度。

6. 分裝樣品，凍存于－70℃。

注意事項：

1. 8 mmol/L PMSF 必須在添加還原劑之前用，否 PMSF 會失去活性。

2. 40 mmol/L 濃度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3. 細胞清洗――大多用 PBS，若 PBS 殘留于細胞表面會造成膠上出現水平條紋 ， 則可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)解此問題。