小 E 今天中午和同事一起吃飯的時(shí)候發(fā)生了以下對話：

聽故事聽到一半的 小 E 懷著強(qiáng)烈的好奇心，一吃完飯就自己去研究了 PCR 技術(shù)的發(fā)展歷程……

原來從 1983 年 Kary Mullis 發(fā)明 PCR 技術(shù)以來，PCR 實(shí)驗(yàn)歷經(jīng)了“三級跳躍式”的發(fā)展歷程。

從zui早期的手工操作 PCR 反應(yīng)，到半自動(dòng)機(jī)械臂在水浴中操作 PCR 反應(yīng)，再到目前已經(jīng)非常成熟的半導(dǎo)體（Peltier）溫控技術(shù)，PCR 設(shè)備對操作人員來說已經(jīng)變得越來越友好，越來越便利。

▲ 水浴式 PCR 儀

在科研工作者做 PCR 實(shí)驗(yàn)的過程中，也從Z開始的能夠擴(kuò)增出核酸，發(fā)展到了能夠更加準(zhǔn)確、更加特異性地以及更加GX地?cái)U(kuò)增出我們所需要的目標(biāo)核酸片段。

而要實(shí)現(xiàn)這樣的要求，就必然對 PCR 實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索和優(yōu)化。

PCR 梯度功能

早期的 PCR 條件優(yōu)化只能一次又一次地不停嘗試各種實(shí)驗(yàn)條件的組合，直到 90 年代中期 Eppendorf 在 5331 系列 PCR 上實(shí)現(xiàn)了不同列之間不同溫度的功能，一次實(shí)驗(yàn)就能夠測試 12 個(gè)不同的條件，一下子將 PCR 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化的效率提高了 10 倍以上，這也是我們所熟知的 PCR 梯度功能。

PCR 創(chuàng)新 2D 梯度功能

PCR 儀作為一個(gè)成熟的設(shè)備，是否還有發(fā)展的空間呢？

答案是肯定的，Eppendorf 在ZX的 Mastercycler^?  X50 系列 PCR 儀上引入了創(chuàng)新的2D 梯度功能。

更方便的溫度步驟優(yōu)化

世界著名的 MPI CBG（Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics）的科學(xué)家，在使用了 Eppendorf Mastercycler^? X50 的 2D 梯度功能后表示，使用 2D 梯度可以非常方便地在一次實(shí)驗(yàn)中對 PCR 反應(yīng)過程中的兩個(gè)溫度步驟進(jìn)行優(yōu)化（如，變性與退火），一次可以摸索 96 個(gè)不同的溫度條件組合。

這樣的條件優(yōu)化對于難以擴(kuò)增的高 GC 含量的模板的條件優(yōu)化顯得尤為重要。

而這使得 PCR 條件優(yōu)化的過程有了全新的可能性。

實(shí)驗(yàn)證明條件優(yōu)化的更多可能性

實(shí)驗(yàn)測試了用 X50 的 2D 梯度功能摸索優(yōu)化小鼠基因 PCR 擴(kuò)增條件來提高產(chǎn)量的方法。

科學(xué)家沒有采用 96 孔板滿板 PCR 的方法來進(jìn)行擴(kuò)增，而是非常機(jī)智地，在盡可能少的實(shí)驗(yàn)量的情況下覆蓋到所有的溫度組合，方案如圖：

藍(lán)色標(biāo)記為實(shí)際的溫度組合以及其對應(yīng) PCR 儀上的孔位。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看：

采用 91 度左右的溫度來進(jìn)行變性反應(yīng)時(shí)的核酸產(chǎn)物Z多，雖然我們一般變性溫度會(huì)使用 94-95 度，但是這次實(shí)驗(yàn)很顯而易見地表明，結(jié)果和我們的傳統(tǒng)認(rèn)識還是有所區(qū)別的，而這個(gè)情況在不具備 2D 功能的 PCR 儀上操作時(shí)幾乎不會(huì)被關(guān)注到。