采訪來自南加州大學轉化成像中心生物醫學工程學院分子與計算生物學系 Francesco Cutrale 博士和 Scott E. Fraser 博士

之所以開發將高光譜拆分（hyperspectral unmixing）與相量分析（phasor analysis）相結合的技術，是為了簡化多色成像的過程。這種組合方法可解決多通道成像中常見的問題，例如熒光團串擾和低效的序列成像（這兩種情況都可能導致丟失信息）。此外，它還有助于改進圖像采集和數據生成，從而提高實驗效率。

我們采訪了這項技術的開發者 Fraser 教授和 Cutrale 博士，希望更深入地了解這種方法及其為日常顯微成像研究工作帶來的潛在益處。

親愛的 Francesco 和 Scott，非常感謝你們今天來到這里并回答我們的問題。你們能否詳細介紹一下如何將高光譜成像與相量分析相結合，以簡化多色成像的過程？你們兩位都是這些領域的專家，或許我們可以先稍微介紹一下這兩種技術。

Cutrale 博士：高光譜（hyperspectral imaging）成像技術已問世一段時間，因為它Z初是為遙感而開發的。例如在陸地上飛行的飛機，或環繞地球的衛星。當您查看彩色圖像時，如果觀察它們的光譜組成，會發現它們可能非常不同。高光譜成像增加了一個新的成像維度，即波長。在高光譜成像中，我們不是在各個通道中依次捕獲單色圖像，而是同時采集具有大量通道的圖像。二十年前，Scott 已經在顯微鏡上采用了這種高光譜探測方法 ，但是他所用的方法在進行拆分時涉及許多復雜的數學運算，這意味著需要區分哪些組分來自樣本中的哪種信號。當時的標準算法是以衛星和遙感成像為中心開發的，因此在這種情況下，光源是太陽。它比顯微成像中的信號強得多，顯微成像的熒光中的信噪比非常低。成像會受噪聲、速度和光子預算限制的影響。

你們如何克服了這些顯微成像特有的障礙？

Cutrale 博士：要獲取這種信息，必須找到一種能夠克服上述各種噪聲的可靠算法，它不僅要能非常簡單地描述單個像素（因為它可能確實會受噪聲影響），而且也要能讓人簡單地了解整個樣本的整個光譜組成。這正是相量分析（phasor analysis）所起的作用。相量分析技術已面世幾十年，在熒光壽命成像（FLIM）領域已經非常成熟。在STELLARIS 8 FALCON 共聚焦系統這一出色的儀器中，徠卡將熒光壽命成像與相量分析相結合。相量分析在熒光壽命成像中意義重大，因為這些只是質量和頻率域的原始信號。因此，我們決定使用相量方法來分離高光譜成像數據，這具有重大的意義。

4色斑馬魚比率高光譜拆分渲染圖：tg((cltca:citrine);(ubiq:lynTomato); (lifact:mRuby);(fli1:mKo2))。南加州大學轉化成像中心 Rose Chiang 提供。

采用相量分析進行高光譜拆分有哪些挑戰？

Cutrale 博士：要對樣本溫和成像時，信號量有限。人們希望在成像和不同樣本類型方面具有靈活性。我們在三年前開始了這項高光譜相量工作，并意識到相量非常有用。它在數據去噪和簡化分析方面起到巨大作用。但我們決定更進一步。通常來說，如果要使用相量，您確實要與相量打交道，就必須了解相量分析，這是一大問題。許多人在額外學習新事物方面猶豫不決，因為他們本來就必須要學習很多東西，或者因為他們實在沒有時間。那么，如果我們能夠利用更加自動化的線性光譜拆分類型，并采用更多樣和更靈敏的相量方法呢？這就是我們所做的工作。我們將標準算法的半自動化與相量的靈敏度和多樣性相結合，將所有因素整合在一起，合并形成一個混合式方法，一個更靈敏、更快速的光譜拆分算法。使用現在這種方法，用戶不愿意的話完全不需要與相量打交道，但仍然可以利用該技術的優勢。

這聽起來是一個真正的突破，祝賀 Francesco！Scott，您認為在生命科學研究中將相量分析與多高譜數據相結合的實際優勢是什么？您會如何對一位將顯微鏡用作諸多實驗室工具之一的癌癥研究者解釋這項技術的工作原理，在他不用學習任何算法和數學知識的情況下對他有什么幫助？

Fraser 教授：簡而言之，這種方法可以讓研究者進行高光譜成像和拆分，而不必成為高光譜成像專家。這很像用多攝像頭智能手機拍攝一張照片后只要按下按鈕就可將其拆分，或者也可以架起一個三腳架，在上面放一部大相機，放入一個照相底片，然后實施這個傳統過程所包含的其他一切步驟。后者是在成像設備中采集熒光顯微成像數據的常見過程：總是找不到合適的濾光片，即使有合適的濾光片，也會有人在上面留下指紋。顯微鏡幾乎總是必須通過多個濾光片進行多次曝光，然后我們采集這些圖像來獲得多色圖像。我走進顯微鏡實驗室拍照，卻發現有人拿走了其中一個濾光片，將其放在另一臺顯微鏡中，然后掉在地板上。但Z主要的是，多色成像通常需要收集多張單獨拍攝的圖像，然后嘗試將這些圖像剪切和粘貼到一起，就像拼接許多圖像。我們方法的強大優勢在于，它既不需要將濾光片移來移去，也不需要在改變濾光片位置后進行多次曝光，更不需要用戶掌握復雜的算法和數學知識。我們為此使用高光譜成像的智能設備。對我來說，這個差別很大。而且，我不必再擔心有人拿走我星期二做實驗需要的濾光片，在星期一將其放在另一臺顯微鏡中。

您能否談談在獲得樣本光譜圖像之后的算法工具呢？它與目前市場上的線性光譜拆分技術或其他光譜拆分技術相比如何？

Fraser 教授：當然，Z明顯的是這種方法對樣本更溫和，但這只是一個方面。Z常見的方法是采集圖像、存儲圖像，然后坐在計算機前進行分析。坐下來收集數據與坐下來處理數據之間的時間差可能非常明顯。現在有一種可以自動而快速地完成這個過程的方法，用戶甚至不會注意到計算過程。就像智能手機從多個攝像頭傳感器采集圖像后合成Z 終看到的圖片一樣，基于相量的分析法會為您收集和分析圖像。我的許多用戶和學生會以為已經完成了工作。但在一周或兩周后，他們找時間進行了分析，才發現并未獲得自己以為已經獲得的結果。這就好比在足球比賽中使用一部老式相機拍照，一段時間后在照片沖印室沖洗膠片，檢查所拍照片是否符合預期。但是，那時足球比賽早已結束，您既不能回到那時再拍照，也不能組織另一場比賽補拍錯過的場景。通過自動化的相量分析，您可以立即從樣本中獲得結果——您坐在顯微鏡前觀察樣本時就可以提取到信息。