Step1:蛋白表達

(1) 密碼子優化+基因模板合成+表達載體構建；

(2) 質粒抽提+轉染（哺乳表達系統）目的蛋白檢測（WB，SDS-PAGE）；

(3) 蛋白表達放大+蛋白親和純化；

交付：表達載體，克隆甘油菌，重組蛋白3-3.5mg，純度>85%，標準實驗報告

4-6周

Step2:動物免疫

(1) 動物免疫4次，加強免疫一針，共計免疫5針；

(2) 免疫前采集陰性血清，第4針采血進行ELISA檢測血清效價；

(3) 若第4針血清抗體效價（蛋白抗原>10^5；多肽抗原>10^4）滿足要求，則采血前7天再次加強免疫1針，如不滿足要求，則繼續常規免疫；

(4) 效價合格，采血分離單核細胞；

動物：背景清晰（年齡，性別，防疫情況）；

免疫：蛋白抗原>10^5；多肽抗原>10^4；

采血：數量100ml以上；

PBMC細胞：>10^5/vial

8-10周

Step3:模板cDNA制備

(1) PBMC總RNA提取（RNA提取試劑盒）

(2) 高保真RT-PCR制備cDNA（反轉錄試劑盒）

cDNA：反轉后>1ug/ul，膠圖分布均勻；

cDNA模板總量>150ug；

1 天

Step4:抗體酵母展示文庫構建

(1) 以cDNA為模板，兩輪PCR擴增VHH基因

酵母表達質粒構建與轉化： VHH基因拼接酵母展示載體，電擊轉化酵母宿主菌，構建抗體庫，電擊次數不低于10次

鑒定：隨機挑選24個克隆，PCR鑒定陽性率+PCR鑒定多樣性+插入率

文庫陽性率：>90%；

文庫插入性率：>90%；

庫容：>10^6

1-2周

Step5:文庫篩選（磁珠+Facs）

(1) 磁珠分選；

(2) FACS分選（免疫雙標分選）；

(3) 鋪板+陽性克隆菌培養+抗體基因測序；（>20個，多達96個）；

陽性標準：雙陽性菌株；

VHH篩選標準：CDR氨基酸序列不同

2-3周

Step6:抗體驗證（體外驗證）

(1) 將獲得的抗體序列構建合適的表達載體進行表達+親和純化+抗體蛋白定量；

(2) Elisa驗證抗體與抗原結合，進行下游驗證（交付EC50數據）;

(3) BLI法驗證抗體親和力；

(4) 細胞功能驗證：流式驗證；

(5) 驗證細胞系（抗原受體過表達細胞系）；

交付：表達載體，克隆菌株，表達菌株，重組抗體蛋白1mg，純度90%；

快速親和力測定結果；

4-6周