產品描述

Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit _{是基于Hieff Clone® 快速克隆技術的定點突變系統。使用本試劑盒，可一次性向目標質粒上三至五個不連續位點（相距超過50bp）同時引入定點突變。該試劑盒由兩個模塊組成：Hieff® II Pfu DNA Polymerase擴增模塊和Hieff Clone® 快速克隆模塊。Hieff® II Pfu DNA Polymerase超高的保真度顯著降低了擴增過程中引入新突變的可能性，其卓越的長片段擴增能力，廣泛適用于長度小于20 kb的任何質粒擴增。Hieff Clone®快速克隆系統利用高效的同源重組反應替代傳統的退火成環反應。因此使用Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit進行DNA定點突變時，引物設計更加靈活，且擴增反應以指數方式進行，極大減少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的徹底降解。}

^{Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit中的重組酶Exnase MultiS經過優化，專門針對多堿基進行定點突變。此外，如擴增產物特異，其DpnI消化產物可不進行DNA純化而直接用于重組反應。高度優化的反應緩沖液、快捷的操作流程以及極高的成功率，使得Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit成為DNA多點突變試劑盒。}

應用范圍

^{DNA定點突變}

^{注：如使用本品對質粒進行定點突變，請使用甲基化酶無缺陷的宿主菌 (例如Top10、DH5α、JM109)擴增原始質粒！}

^產品組成

編號	組分	產品編號/規格
		11004ES10 （10 T）
11004-A	2×Hieff® II PCR buffer	1.25 mL
11004-B	dNTP Mix (10 mM each)	50 μL
11004-C	Hieff® II Pfu DNA Polymerase (1 U/μL)	50 μL
11004-D	Dpn I (10 U/μL)	50 μL
11004-E	2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix	100 μL

運輸與保存方法

^{冰袋（wet ice）運輸。產品-20℃保存。有效期1年。}

不連續多堿基（相距超過50bp）定點突變實驗流程（以不連續三堿基為例）

^{實驗流程概覽（圖一）}

                  

^{圖一：使用Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit進行不連續三堿基定點突變實驗流程}

^{1. 引物設計}

^{向質粒三個不連續位點引入定點突變，只需設計三對引物將質粒分段擴增即可。引物設計基本原則為：在每個待突變位點處設計部分反向互補的擴增引物對。每對正反向引物5’端包含15-21 bp反向互補區域（GC含量40%-60%為佳），各引物待突變位點至引物3’端區域Tm值高于60℃為佳。所需引入突變可以包含在互補區域內 (需要兩條引物上均引入點突變)，也可以包含在任一條引物的非互補區域 (只需在一條引物上引入點突變)，請勿將突變位點置于引物末端。以向pUC18引入三堿基突變為例，引物設計具體方案如圖二所示。}

 

圖二：向質粒引入不連續多堿基定點突變引物設計示意圖

^{注：待突變位點B、C處的正反向擴增引物設計方式與位點A 處的引物設計方式一致。計算引物Tm值時，應計算待突變位點至引物3’端這一區域內的堿基，待突變位點至引物5’端區域內的堿基不應參與計算。}

^{2. 目標質粒分段擴增}

^{以待突變位點A、B、C為界，將質粒分為AB、BC段和CA段。使用Hieff® II Pfu DNA Polymerase對各段分別進行擴增。AB段擴增引物對為：待突變位點A正向擴增引物和待突變位點B反向擴增引物；BC段擴增引物對為：待突變位點B正向擴增引物和待突變位點C反向擴增引物；CA段擴增引物對為：待突變位點C正向擴增引物和待突變位點A反向擴增引物。}

^{2.1 配制PCR反應體系
反應各組分解凍后請充分搖勻，使用完畢后及時放回-20℃。2×Hieff® II PCR buffer請勿長時間敞口放置。
為了增加擴增特異性，反應體系配制過程請于冰水浴中進行。為了防止Hieff® II Pfu DNA Polymerase的校對活性降解引物，請將聚合酶最后加入反應體系中。}

^{推薦反應體系如下：}

ddH2O	Up to 50 μL
2×Hieff® II PCR buffer	25 μL
dNTP Mix (10 mM each) a	1 μL
模板DNA b	Optional
引物1 (10 μM)	2 μL
引物2 (10 μM)	2 μL
Hieff® II Pfu DNA Polymerase (1 U/μL) c	1 μL

^{a. 請勿使用dUTP和帶有尿嘧啶的引物或模板。
b 在各片段能正常擴增的前提下，應盡量減少質粒模板使用量，推薦≤1 ng。待擴增質粒長期放置、反復凍融會導致模板質粒斷裂、開環或降解，因此推薦使用新鮮制備的質粒作為模板。
c. 推薦的酶的終濃度為1 U/50 μl反應。可將Hieff® II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之間進行優化，但不要超過2 U/50 μl，尤其當擴增子長度大于5 kb時。}

 

^{2.2 PCR擴增反應}

^{推薦PCR反應條件：}

循環步驟	溫度	時間	循環數
預變性	95℃	30 sec	1
變性a 退火b 延伸c	95℃ 60℃～72℃ 72℃	15 sec 15 sec 30-60 sec/kb	30 d
徹底延伸	72℃	5 min	1

^{a. 對于大多數質粒，變性溫度使用95℃即可。}

^{b. Hieff® II Pfu DNA Polymerase能夠促進模板和引物高效退火。一般來說，退火溫度設置為引物Tm值即可。如果需要，可以建立一個溫度梯度反應去尋找引物模板結合的最適溫度。退火時間太長可能導致擴增產物在膠上呈現彌散狀。}

^{c. 對于大多數擴增反應，延伸過程可在72℃進行。長的延伸時間有助于提高擴增產量。}

^{d. 為了防止擴增過程中引入非目標突變，強烈建議擴增循環數≤35。如果擴增效率良好的話，推薦擴增循環數應≤30。}

^{反應結束后取少量擴增產物進行瓊脂糖電泳檢測。如目標質粒正確擴增，則可進行下步實驗。}

^{3. 擴增產物DpnI消化，去除甲基化模板質粒
因上述擴增產物中包含原始模板質粒，為防止其在轉化后形成假陽性轉化子，必須在進行重組環化之前進行DpnI消化。}

^{推薦反應體系如下：}

DpnI	1 μL
擴增產物	40～50 μL

^{將上述反應體系置于37℃恒溫反應1～2小時。如產物擴增特異，產物條帶單一，DpnI消化產物無需純化，可直接用于后續重組反應。如擴增不特異，DpnI消化結束后應膠回收純化目標擴增產物。}

^{4. 重組反應}

^{4.1 配制重組反應體系}

^{質粒AB、BC和CA段擴增產物末端分別包含相對應的完全一致的一段序列，因此在Exnase MultiS催化下三擴增產物末端可以發生同源重組，完成擴增產物環化過程。于冰水浴中，將下列組分依次加到無菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎將液體粘在管壁，請務必通過短暫離心使其沉入管底。體系配制完成后，用移液器上下輕輕吹打幾次混勻各組分，避免產生氣泡 (請勿劇烈震蕩或者渦旋混勻)。}

ddH2O	Up to 20 μL
AB段DpnI消化產物	x ng
BC段DpnI消化產物	x ng
CA段DpnI消化產物	x ng
2× Hieff Clone® MultiS Enzyme Premix	10 μL

^{Exnase MultiS多點突變重組反應體系最適DNA使用量為每片段0.03 pmol。該摩爾數對應的DNA質量可由以下公式粗略計算獲得：}

^{DpnI消化產物最適使用量 = [0.02 × 目標質粒堿基對數] ng (0.03 pmol)}

^{例如，AB段長度為1 kb，BC段長度為2 kb，CA段長度為5 kb。則DpnI消化產物最適使用量為：AB段0.02 × 1000 = 20 ng；BC段0.02 × 2000 = 40 ng；CA段0.02 ×5000 = 100 ng。} 

^{注：DNA量太多或者太少都將降低環化效率。常用的吸光度測量法極易受DNA純度、DNA稀釋液pH等因素影響，測定值和DNA實際濃度往往偏差較大。因此，請務必通過瓊脂糖電泳預先確認DNA濃度，盡量嚴格按照推薦量配制反應體系。當DpnI消化產物最適使用量計算值不足10 ng或者超過200 ng時，加入10ng或200 ng即可。DpnI消化產物不純化直接用于重組反應時，使用量不應超過反應總體積的1/5，即4μl。}

^{4.2 重組反應}

^{1）將上述體系置于50℃反應 20-50 min。}

^{2）待反應完成后，立即將反應管置于冰水浴中冷卻5 min。}

^{3）之后，反應產物可直接進行轉化；也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。}

^{5. 反應產物轉化、涂板、克隆鑒定}

^{1）取10 μl冷卻反應液，加入到100 μl感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置30 min。}

^{2）42℃熱激45～90秒，冰水浴孵育2 min。}

^{3）加入900 μl SOC或LB培養基，37℃孵育10min充分復蘇。}

^{4）37℃搖菌45 min。}

^{5）取100 μl菌液均勻涂布在含有適當抗生素的平板上。將平板倒置，于37℃過夜培養。}

^{注：我們推薦您使用轉化效率>108 cfu/μg的感受態細胞。如果感受態轉化效率<108 cfu/μg (例如用CaCl2法新鮮制備的感受態轉化效率通常在106-107 cfu/μg之間)，請將培養菌液在5,000 rpm離心3 min收集菌體，用100 μl LB培養基重懸后全部涂板。}

注意事項

^{1）引物設計時5’端反向互補區盡量選擇無重復序列，且GC含量比較均勻的區域。當這一區域內GC含量在40%～60%范圍之內時，重組環化效率將達到最大。如這部分區域GC含量高于70%或者低于30%，重組環化效率會受到較大影響。}

^{2）當兩突變位點相距小于50bp時，應將其視為一個突變位點，將兩突變引入同一條/對引物進行實驗。}

^{3）DpnI只能識別甲基化DNA，請務必使用從甲基化酶無缺陷的宿主菌中擴增的質粒作為PCR模板。}

^{4）質粒PCR擴增結果需高度特異，雜帶較多會影響實驗結果。
5）重組反應體系中應盡量避免金屬絡合劑(如EDTA)的帶入。因此，建議將DNA純化產物溶解在pH8.0的ddH2O中保存(常規膠回收試劑盒中的洗脫液可用pH8.0的ddH2O替代)，請勿使用TE進行DNA保存。
6）冷卻后的反應產物應在1h內進行轉化，且轉化前保持在冰水浴中。如需儲存，于-20℃凍存。盡量避免室溫較長時間放置或4℃長期儲存。
7）反應產物的轉化體積不應超過感受態細胞體積的1/10，否則會降低轉化效率。另外，當轉化的DNA濃度太高時，會抑制轉化反應。將重組反應產物稀釋5倍后取1/5進行轉化。}

^{8）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
9）本產品僅作科研用途！}

相關產品

產品名稱	貨號	規格
Hieff Canace® High-Fidelity DNA Polymerase 高保真DNA聚合酶HOT	10135ES60/76/80	100/500/1000 U
2×Hieff Canace® PCR Master Mix高保真酶預混液HOT	10136ES03/08/25	1/5/25 mL
一步法快速克隆試劑盒HOT	10911ES20	20 T
多片段一步法快速克隆試劑盒HOT	10912ES10	10 T
定點突變試劑盒HOT	11003ES10	10 T

^HB211209