產品信息 

產品名稱	產品編號	規格	價格
FITC Phalloidin FITC標記鬼筆環肽	40735ES75	300 T	1533.00

 

背景描述

鬼筆環肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結合，通常用來標記組織切片，細胞培養物或無細胞體系中的F-actin，從而對F-actin進行定性和定量分析。另外，鬼筆環肽衍生物也以相近的親和力結合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環肽分子的計量比結合。非特異性結合幾乎可忽略，染色區域和非染色區域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進行相關研究。另外鬼筆環肽衍生物很小，直徑約12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未標記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發生反應；鬼筆環肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質；以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。

鬼筆環肽（Phalloidin）的結合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩定微絲結構，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發生的臨界濃度（CC）降至＜1 µg/mL，因此，可用作一種聚合促進劑。此外，鬼筆環肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品為FITC標記的鬼筆環肽，染色反應特異性強，對比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測。另外，經本品結合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學特性。且本品的結合沒有物種差異性，適用性廣泛。

我司提供儲存液形式（濃度為20 µM）的FITC標記鬼筆環肽，用戶根據自身需求選擇，建議使用濃度為80~200 nM。

 

產品性質

分子式（Molecular Formula）	C56H60N10O15S2
分子量（Molecular Weight）	1177.3
最大激發/發射波長（Ex/Em）	495~496/513~516 nm
多肽序列（Sequence）	FITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-Leu)(S-3 to 6)
外觀（Appearance）	淡黃色至黃色溶液

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20 ℃避光干燥保存，1年有效。

 

注意事項

1）鬼筆環肽具有毒性，需小心操作（對人的半數致死劑量LD₅₀約2 mg/kg）。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3）本產品僅作科研用途！

 

需要自備材料

1）（可選）甲醇

2）1×PBS緩沖液，pH 7.4，細胞培養級別

3）固定液4%多聚甲醛（溶于PBS緩沖液）

4）丙酮或透化液0.5% Triton X-100（溶于PBS緩沖液）

5）Fluoromount-G^TM 水溶性封片劑（不含DAPI）（貨號：36307ES08），DAPI（貨號：40727ES10）

6）（可選）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（含DAPI）（貨號：36308ES11）

7）（可選）BSA，標準級別（貨號：36101ES25）

8）載玻片和蓋玻片

9）蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）

10）組裝有FITC激發/發射濾片，以及DAPI激發/發射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡

操作步驟

1. 工作液準備

本品以溶于甲醇的20 µM儲存液形式提供，總量為300 µL。按照100 nM的工作液濃度來換算，可制備總量為60 mL的工作液。建議收到產品后，根據單次使用量，對母液進行小量分裝，-20 ℃避光凍存，一年穩定。

開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200 nM。工作液現配現用。

2. 染色步驟

1）細胞爬片生長24 h，使其密度達到50%匯合度。

2）吸掉培養液，37℃預熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細胞2次。

3）使用溶于PBS的4%甲醛溶液進行細胞固定，室溫固定10 min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。

4）室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10 min。

5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5 min。

6）室溫條件下，用PBS清洗細胞2~3次，每次10 min。

7）取200 µL配制好的 FITC標記鬼筆環肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細胞，室溫避光孵育30 min（通常情況下，4 ℃~37 ℃孵育皆可）。

注意：為了降低背景，可于FITC標記的鬼筆環肽工作液內加入1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發，可將蓋玻片轉移到一個密封的容器內。

8）用PBS清洗蓋玻片3次，每次5 min。

9）使用200 µL DAPI溶液（濃度：100 nM）對細胞核進行復染，約30 s。

10）用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經滴有一滴Fluoromount-G^TM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標本玻片可置于4 ℃避光保存，通常6個月內可繼續做F-actin染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑（貨號：36308ES11）合并步驟9）10），簡化步驟。

11. 熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察，選擇FITC激發/發射濾片（Ex/Em=496/516 nm）和DAPI激發/發射濾片（Ex/Em=364/454 nm）。

 

HB240410