Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit是兼容Illumina和MGI雙平臺的total RNA測序文庫構建試劑盒，包含RNA片段化試劑，反轉錄試劑，常規和鏈特異性ds-cDNA合成試劑，以及文庫擴增試劑?？梢糟暯觤RNA純化試劑盒或rRNA去除試劑盒構建測序文庫。二鏈合成模塊配有兩種Buffer，客戶可根據需要進行常規建庫或鏈特異性建庫。其中鏈特異性二鏈合成Buffer中將dTTP替換為dUTP，使cDNA第二鏈中摻入dUTP，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無法擴增含尿嘧啶的DNA模板，實現鏈特異性。提供的所有試劑都經過嚴格的質量控制和功能驗證，最大程度上保證了文庫構建的穩定性和重復性。

產品信息

貨號	12308ES08 / 12308ES24 / 12308ES96
規格	8 T / 24 T / 96 T

組分信息

組分編號		組分名稱	12308ES08	12308ES24	12308ES96
12308-A		2× Frag/Prime Buffer	80 μL	250 μL	930 μL
12308-B		1st Strand Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12308-C		Strand Specificity Reagent	50 μL	150 μL	580 μL
12308-D		2nd Strand Buffer (dNTP)	240 μL	720 μL	2×1440 μL
12308-E		2nd Strand Buffer (dUTP)	240 μL	720 μL	2×1440 μL
12308-F		2nd Strand Enzyme Master Mix	40 μL	120 μL	480 μL
12308-G		Ligation Enhancer	240 μL	720 μL	2×1440 μL
12308-H		Novel T4 DNA Ligase	40 μL	120 μL	480 μL
12308-I		2×Super Canace® II High-Fidelity Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
12308-K		Nuclease Free H2O	100 μL	300 μL	1000 μL
12308-*	*	Primer mix	NA	NA	NA
注*：Primer mix為實驗必須試劑，但是該成分不包含在本試劑盒，需要額外配置。本試劑盒組分兼容Illumina和MGI雙平臺，但需要額外配置專屬于Illumina®或者MGI®的primer mix(Cat# 13335 Primer Mix for Illumina®以及Cat# 13334 Primer Mix for MGI®)。

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用說明

實驗前請仔細閱讀：
一、關于接頭連接 (Adapter Ligation)

1. 本公司可提供Illumina®或者MGI®長接頭(Barcoded Adapter)試劑盒和短接頭試劑盒，客戶可根據實驗需求進行選擇。

2. 我們建議選用高質量的商業化接頭。如客戶使用自制接頭，請委托具有NGS引物合成經驗的公司，并備注需進行嚴格的防污染控制。此外，進行接頭退火操作時，請在超凈臺完成。每次只操作一種接頭，防止交叉污染。

3. 使用接頭時，請提前將接頭取出放在4°C或冰盒上解凍；在室溫操作時，實驗室溫度最好不要超過25°C，防止接頭解鏈。

4. 建庫過程中，接頭濃度過高或過低都會導致建庫成功率變低。本試劑盒操作方案中，所加入的接頭體積固定為5 μL，請根據初始的RNA投入量，參考表1對接頭進行稀釋。接頭稀釋液請選擇0.1×TE buffer，稀釋過的接頭可在4°C保存48小時。

表1-1 Input Total RNA量與Illumina®接頭使用濃度推薦表

Input Total RNA	Illumina® Adapter stock concentration
10 ng	1 μM
100 ng	1.5 μM
500 ng	3 μM
≥1 μg	5 μM

表1-2  Input Total RNA量與MGI®接頭使用濃度推薦表

Input Total RNA	MGI® Adapter stock concentration
100–499 ng	2 μM
500–4000 ng	5 μM

*可根據不同類型total RNA樣本及投入量，按需求適當調整Adapter使用量

二、關于文庫擴增 (Library Amplification)

1. 本試劑盒中的文庫擴增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成，在第一代的基礎上，大大增強了擴增的均一性，即使是低拷貝的基因，也能進行無偏好性地擴增。

2. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環數。循環數不足，將導致文庫產量低；循環數過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表2列舉了使用本試劑盒進行文庫擴增，Input Total RNA 量與相應擴增循環數的推薦。

3. 表2中推薦的循環數可滿足絕大多數建庫需求，若您的樣本質量較差（如降解嚴重的FFPE樣本），可根據實際情況適當增加循環數。mRNA建庫時請特別注意，由于不同物種和組織所提取的 Total RNA中，mRNA的含量差異較大，實驗中需根據建庫起始量、物種類型及樣本處理情況適當調整擴增循環數。

表 2 Input Total RNA 量與擴增循環數推薦表*

Input Total RNA	Number of cycles
	Non-stranded	Stranded
10 ng	15	15
100 ng	14	14
500 ng	12	13
1 μg	11	12

【注】：*由于文庫產量不僅與投入量和擴增循環數相關，樣本質量、片段化條件、分選條件等都會影響產量。建庫過程中請根據實際情況綜合考慮，選擇最合適的建庫條件。

三、DNA磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠，我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選。

2. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

4. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續文庫質量。

5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現用現配，否則將影響回收效率。

6. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。

7. DNA純化或長度分選產物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫，產物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個月。

四、關于文庫質檢 (Library Quality Analysis)

1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。

3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物及其他不完整雙鏈結構產物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。

4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。

5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。

五、自備材料 (Other Material)

1. mRNA富集試劑盒：Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit V2 (Yeasen Cat#12629)。

2. rRNA去除試劑盒：Hieff NGS MaxUp Human rRNA Depletion Kit(rRNA & ITS/ETS) (Yeasen Cat#12257)或其他rRNA去除試劑盒。

3. RNA純化磁珠： Hieff NGS® RNA Cleaner (Yeasen Cat#12602)或其他等效產品。

4. DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效產品。

5. RNA質控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產品。

6.  Adapters：Complete Adapter for Illumina®使用（Cat#13519-13520或其他等效產品）或Complete Adapter for MGI®使用（Cat#13360-13362或其他等效產品）。

7. 文庫質檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產品；文庫定量試劑。

8. 其他材料：無水乙醇、無菌超純水、低吸附槍頭、PCR管、磁力架、PCR儀等。

六、建庫流程圖

 圖1 RNA建庫原圖流程圖