RNase活性檢測試劑盒（熒光標記法）使用一種新型RNA底物，其一端標記有熒光報告基團分子(Fluor)，另一端標記有淬滅基團。在不存在RNase時，淬滅基團的物理接近會將熒光報告基團中的熒光淬滅到極低水平。當有RNase時，RNA底物被水解，熒光報告基團和淬滅基團在溶液中的空間上發(fā)生分離，這導致Fluor在被適當波長的光激發(fā)時發(fā)出明亮的熒光，該熒光可以通過多功能酶標儀（含熒光模塊）和基于濾光片或單色器的熒光計進行檢測。

RNase活性檢測試劑盒（熒光標記法）采用底物熒光標記法，可定量或定性的檢測單個樣品中的RNase，從而判斷樣本是否有RNase污染。

 

產(chǎn)品信息

貨號	41309ES96 / 41309ES97
規(guī)格	1×96 T / 5×96 T

 

組分信息

組分編號	組分名稱	41309ES96	41309ES97
41309-A	RNase Substrate	1 tube	5×1 tube
41309-B	10×RNase buffer	1 mL	5 mL
41309-C	RNase A (≈1×10-4 U/μL)	100 μL	500 μL
41309-D	DEPC-treated Water	10 mL	50 mL
41309-E	Surface RNase Remover	50 mL	250 mL

 

運輸和儲存條件

1. 所有組分均干冰運輸，有效期1年。

2. 收到貨后，請先檢查共5個組分是否齊全，再將41309-E組分2-8℃保存，其它組分-25~-15℃保存，避免反復(fù)凍融。

 

注意事項

1. 本產(chǎn)品僅作科研用途。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應(yīng)規(guī)范操作，包括樣本處理、反應(yīng)體系的配制及加樣。

4. 每個組分在使用前都應(yīng)充分震蕩混勻，低速離心。

5. 加樣和配液步驟請嚴格在冰上操作，以減緩上機前酶對底物的消耗。

6. 實驗需使用低吸附耗材以降低酶損耗。

7. 定量實驗需使用黑色酶標板以最大程度減少本底熒光。

 

使用說明

1. 適用機型

包含但不限于以下儀器：

Thermo Scientific: Invitrogen Qubit 4;

Molecular Devices: SpectraMax M3.

2. 實驗前準備

1）在整個實驗開始前，請先使用試劑盒中的Surface RNase Remover對實驗環(huán)境進行處理（可稀釋10倍進行噴灑或擦拭，具體可參考翌圣10609ES60使用說明書），以降低RNase污染。

2）本品可對具備活性的RNase進行檢測及估值，在實驗過程中可根據(jù)實際情況選擇定性檢測或者定量檢測方法。

3. 定性檢測方法

使用終點法在熒光儀或酶標儀上對待測樣本進行讀數(shù)，以Thermo公司Invitrogen Qubit 4熒光儀為例：

1）溶解RNase Substrate：取1管RNase Substrate干粉，高速離心，緩慢打開瓶蓋加入1 mL DEPC-treated Water備用。

2）配制反應(yīng)體系：每次實驗均需制備陰性對照、陽性對照和待測樣本體系。具體操作如下（按順序加入下列試劑并混勻）：

陰性對照反應(yīng)體系	體積(μL)
DEPC-treated Water	160
10×RNase buffer	20
RNase Substrate	20
總體積	200

表1 陰性對照反應(yīng)體系

陽性對照反應(yīng)體系	體積(μL)
DEPC-treated Water	140
10×RNase buffer	20
RNase Substrate	20
5 pg/μL RNase A*	20
總體積	200

表2 陽性對照反應(yīng)體系

^*試劑盒C組分的RNase A參考品稀釋20倍約為5 pg/μL的RNase A。

待測樣本反應(yīng)體系	體積(μL)
DEPC-treated Water	140
10×RNase buffer	20
RNase Substrate	20
待測樣本	20
總體積	200

表3 待測樣本反應(yīng)體系

^*若待測樣本污染較輕可增加待測樣本體積，最大可增加至160 μL，相應(yīng)減少DEPC-treated Water添加量，最小可減少至0，保持總體積不變。

3）檢測初始熒光值：以Qubit4為例，對陰性對照、陽性對照和待測樣本進行檢測，選擇“Fluorometer”進入熒光檢測界面后，再選擇“Blue”進行檢測，并記錄初始熒光值“RFU₀”。

4）37℃孵育讀值：將陰性對照、陽性對照和待測樣本均放入37℃恒溫箱孵育60 min后，重復(fù)步驟3，記錄終末熒光值“RFU₆₀”。5）結(jié)果判讀：若陰性對照熒光值孵育前后變化不超過50%，陽性對照RFU₆₀遠大于2RFU₀，且待測樣本RFU₆₀≥2RFU₀，則判定待測樣本被RNase污染。

4. 定量檢測方法

使用多功能酶標儀對RNase進行實時監(jiān)測并定量，使用此方法可以獲得RNase消化底物的實時曲線。以Molecular Devices公司SpectraMax M3多功能酶標儀為例：

1）溶解RNase Substrate^*：取1管RNase Substrate干粉，高速離心，緩慢打開瓶蓋加入1 mL DEPC-treated Water備用，該干粉加入DEPC水后，可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過3個月），使用時避免反復(fù)凍融。

2）稀釋RNase A^**：對試劑盒中RNase A梯度稀釋，濃度依次為5 pg/μL、2.5 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL。操作如下：

a. 取1.5 mL潔凈離心管，加入495 μL DEPC-treated Water，再加入5 μL 10×RNase buffer，即獲得500 μL 0.1×RNase buffer，用于后續(xù)配置梯度稀釋液，配置前請將溶液輕微振蕩混勻。

b. 取5支潔凈的1.5 mL離心管，分別標記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4。

c. 在標記為Std0^***的1.5 mL離心管中加入45 μL 0.1×RNase buffer和5 μL試劑盒中提供的RNase A(≈1×10^-4 U/μL)，即稀釋為10 pg/μL（≈1×10^-5 U/μL）的RNase A。

d. 在Std1、Std2、Std3、Std4管中先分別加入下表所示體積的0.1×RNase buffer，再進行梯度稀釋，具體稀釋方法如下：

稀釋管	稀釋比例	終濃度
Std1	30μL Std0 + 30μL 0.1×RNase buffer	5 pg/μL
Std2	30μL Std1 + 30μL 0.1×RNase buffer	2.5 pg/μL
Std3	20μL Std2 + 30μL 0.1×RNase buffer	1 pg/μL
Std4	5μL Std3 + 45μL 0.1×RNase buffer	0.1 pg/μL

表4 標準品梯度稀釋

^*為減少反復(fù)凍融次數(shù)和避免污染，建議初次使用時將稀釋好的RNase Substrate分裝儲存于-25~-15℃。

^**已知試劑盒中的RNase A濃度為≈1×10^-4 U/μL，且對于RNase A的單位U和pg的換算關(guān)系為5×10^-7 U≈0.5pg。

^***Std0配制：將試劑盒中RNase A由1×10^-4 U/μL稀釋至1×10^-5 U/μL，因5×10^-7 U≈0.5pg，則1×10^-5 U≈10pg，故1×10^-5 U/μL≈10pg/μL。

3）標準品和待測樣本的反應(yīng)體系配制：

a. 標準品和陰性對照的Mix混合液配制：通常包括4個濃度梯度的RNase A參考品標準曲線和1個無模板對照NTC共5個樣本，每個樣本2個重復(fù)孔，再加1孔的損失量，共計11個孔。具體操作如下（按順序加入下列試劑并混勻）：

Mix混合液	體積(μL)
DEPC-treated Water	770 （11*70）
10×RNase buffer	110 （11*10）
RNase Substrate	110 （11*10）
總體積	990 （11*90）

表5 Mix混合液配制體系

標準品和陰性對照反應(yīng)體系配制：將上述配制的Mix混合液以90 μL/孔進行分裝，再添加10 μL/孔稀釋好的RNase A參考品或10 μL/孔的陰性對照（可用0.1×RNase buffer作為陰性對照）。具體操作如下：

標準品反應(yīng)體系	體積(μL)
DEPC-treated Water	70
10×RNase buffer	10
RNase Substrate	10
RNase A參考品梯度稀釋液	10
總體積	100

表6 標準品反應(yīng)體系

陰性對照反應(yīng)體系	體積(μL)
DEPC-treated Water	70
10×RNase buffer	10
RNase Substrate	10
0.1×RNase buffer	10
總體積	100

表7 陰性對照反應(yīng)體系

b. 待測樣本反應(yīng)體系配制（按順序加入下列試劑并混勻）：

待測樣本反應(yīng)體系	體積(μL)
DEPC-treated Water	70
10×RNase buffer	10
RNase Substrate	10
待測樣本*	10
總體積	100

表8 待測樣本反應(yīng)體系

^*若待測樣本污染較輕可增加待測樣本體積，最大可增加至80 μL（待測樣本的本底檢測與之保持一致），相應(yīng)的減少DEPC-treated Water添加量，最小可減少至0，保持反應(yīng)體系總體積不變。

c. 待測樣本的本底檢測反應(yīng)體系配制：

待測樣本的本底反應(yīng)體系*	體積(μL)
DEPC-treated Water	90
待測樣本**	10
總體積***	100

表9 待測樣本的本底反應(yīng)體系

^*建議每次進行RNase活性檢測時，針對每個初次測試的待測樣本都增加不含RNase Substrate的本底熒光檢測，若本底熒光偏高則計算時應(yīng)減去。

^**每次進行RNase活性檢測實驗時，標準品、陰性對照、待測樣本、待測樣本的本底檢測等都至少做2個重復(fù)孔。

^***為確保檢測的準確性，所有樣本進行加樣時，請務(wù)必在冰上操作。

4）下表為參考板位：

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

標準曲線Std1

標準曲線Std1

待測樣本TS1

待測樣本TS1

TS1本底檢測

TS1本底檢測

B

標準曲線Std2

標準曲線Std2

待測樣本TS2

待測樣本TS2

TS2本底檢測

TS2本底檢測

C

標準曲線Std3

標準曲線Std3

待測樣本TS3

待測樣本TS3

TS3本底檢測

TS3本底檢測

D

標準曲線Std4

標準曲線Std4

待測樣本TS4

待測樣本TS4

TS4本底檢測

TS4本底檢測

E

待測樣本TS5

待測樣本TS5

TS5本底檢測

TS5本底檢測

F

待測樣本TS6

待測樣本TS6

TS6本底檢測

TS6本底檢測

G

待測樣本TS7

待測樣本TS7

TS7本底檢測

TS7本底檢測

H

NTC

NTC

待測樣本TS8

待測樣本TS8

TS8本底檢測

TS8本底檢測

表10 上機參考板位

該示例是對RNase活性檢測的熒光標記法的操作展示，檢測樣本包括：4個濃度梯度的RNase A標準曲線、1個無模板對照NTC、8個待測樣本TS、8個待測樣本對應(yīng)的本底檢測。建議每個樣本做2個重復(fù)孔。

5）儀器設(shè)置：使用酶標儀進行本實驗，選擇96孔板動力學模式以及熒光檢測模塊，選擇中等增益，設(shè)置激發(fā)光490 nm，發(fā)射光520 nm；以1 min間隔讀取數(shù)據(jù)，37℃恒溫連續(xù)讀數(shù)1 h（視待測物污染情況而定），此方法可實時監(jiān)控體系動態(tài)。

6）結(jié)果判讀：

a. 若RFU₆₀≥2RFU₀，則判定待測樣本被RNase污染。

b. 若判定樣本已污染，則制作標準曲線檢測待測樣本RNase污染含量（以下示例顯示總體系的污染含量，如：標準品5 pg/μL，加樣量10 μL，即總體系含量50 pg）：

c. 以標準品開始讀數(shù)時的前幾分鐘（可從時間曲線上判斷線性增長期并選擇合適的時間點，如下圖一般選擇0-3 min）所得數(shù)據(jù)制作標準曲線，再結(jié)合標準曲線和待測樣本在此時間點的熒光值可得其RNase污染的估值，也可通過實時熒光曲線趨勢判斷待測樣本中RNase的污染情況。

圖1 RNase活性檢測試劑盒動力曲線

d. 示例：已知待測樣本的RFU₆₀≥2RFU₀，選擇2 min時標準品各稀釋梯度對應(yīng)的RFU制作標準曲線（如下圖），將待測樣本2 min時的RFU值代入標曲公式，即得待測樣本整體的RNase活性濃度。

圖表2 2min時的標準曲線

   【注】：

1. 該試劑盒測定的是待測樣本體系整體的RNase活性殘留。
2. 試劑盒利用RNase對底物特異性切割的特性進行檢測，因此具有使蛋白質(zhì)變性及含有使RNA單鏈斷裂的物質(zhì)不適用此試劑盒。
3. 深色液體會對熒光收集產(chǎn)生影響，可能會影響結(jié)果準確性。
4. 部分待測樣本由于過酸、過堿或鹽離子濃度過高抑制RNase的活性，可視情況對待測樣本進行稀釋后檢測。
5. 在使用定量方法檢測時，儀器有時初始熒光值會虛高，請觀察時間曲線選擇最低熒光值作為RFU₀進行污染判斷。

 

Ver.CN20230816