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2025-01-10 17:02:33多色熒光標記原理: 多色熒光標記原理是指利用不同波長的熒光染料對同一細胞或組織中的多種生物分子進行標記，通過特定的熒光顯微鏡或成像系統觀察并區分這些染料所發出的熒光信號，從而實現對多種生物分子的同時檢測和定位。這種技術能夠大大提高實驗效率和準確性，廣泛應用于生物學、醫學等領域的研究中，如細胞分選、蛋白質相互作用分析、基因表達研究等。通過多色熒光標記，研究人員可以更深入地了解生物分子的功能和相互作用關系。

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多色熒光標記原理問答

2022-07-22 15:27:25熒光定量PCR實驗，熒光標記怎么選？: 熒光定量PCR技術是將常規的PCR和熒光檢測技術相結合，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，以此實現對初始模板的定量分析。熒光定量PCR技術作為當今生物學研究的重要手段之一，在基礎科學、生物技術、醫學研究、法醫學、診斷學等多方面具有廣泛的應用前景。說到熒光定量PCR技術，我們經常會問類似于“你的實驗是染料法還是探針法”，“你用的探針是什么類型”等之類的問題，這其實是對熒光標記的選擇。根據熒光標記的不同，可以將熒光定量PCR實驗分為探針法和染料法兩大類。染料法染料法利用能與DNA雙鏈結合的染料來實現，如SYBR Green I。該染料在游離狀態下呈現微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA的雙螺旋小溝結合，其綠色熒光增強約1000倍。因此其總的熒光強度與雙鏈DNA含量成正比，利用這一關系可以反映生成的PCR產物的量（圖 1）。SYBR Green I的吸收約在497 nm，發射波長約在520 nm，與FAM熒光分子的光譜性質類似，因此在所有的熒光定量PCR設備中都是通道檢測，即“FAM/SYBR Green I”通道。▲ 圖1 染料法原理圖理論上，所有能與雙鏈DNA結合的染料都可以用于qPCR檢測，如溴化乙錠EtBr，碘化丙啶PI，吖啶橙、Cy3等。而選擇用于qPCR反應的染料通常會從信號強度、生物安全性、檢測簡便性和經濟適用性這幾個因素考慮。例如EtBr可能存在潛在的致癌性。綜合考慮下來，SYBR Green I成了比較理想的選擇。目前，使用Evagreen的實驗者也越來越多，Evagreen作為一種新型的染料，其光譜性質與SYBR Green I類似，其優勢在于：? 對PCR反應的抑制程度小。高濃度SYBR Green I會強烈抑制PCR反應，因此要控制其使用濃度，一定程度上降低了DNA檢測的靈敏度。? 與DNA結合密度高。單位長度的DNA雙鏈上Evagreen的密度更高，為飽和型染料，消除了SYBR Green I存在的“染料重分布”的缺陷，提高檢測靈敏度的同時也可用于高分辨率溶解曲線HRM。? 化學性質更穩定，適合長期保存。TaqMan 探針TaqMan 探針基本可以滿足60%以上的qPCR實驗，如常規的基因表達和拷貝數變異CNV實驗。TaqMan 熒光探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5'末端，而淬滅劑則在3'末端（圖2）。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收; PCR擴增時, Tag酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。常用的熒光基團是FAM，TET，VIC，HEX。▲ 圖2 Taqman探針MGB探針對于要分辨單堿基差異的SNP實驗，采用對堿基錯配容忍度更低的MGB探針，在淬滅基團后加入了DPI3基團（圖3），從而提高了與靶標結合的親和力；而且可以對靶點堿基進行化學修飾，如PeptideNucleic Acid和Locked Nucleic Acid。▲ 圖3 MGB探針雙雜交探針Taqman探針對探針的長度有比較嚴格的要求，雙雜交探針則消除了這一“缺陷”。雙雜交探針是由兩條寡核苷酸單鏈組成，一條的3’端帶有供體熒光分子，另一條的5’端帶有受體熒光分子（圖4）。游離狀態下熒光供體會發出熒光，但當兩條單鏈都匹配到模板鏈上時，就會發生熒光共振能量轉移FRET，受體熒光分子就可以發出熒光，其熒光強度與生成的產物的量成正比。雙雜交探針的優勢有兩點：擺脫了探針長度的限制，較長的探針可以提高與模板匹配的成功率；只有上下游兩條探針都正確匹配后才能檢測到受體熒光分子發出的熒光，特異性有所提高。▲ 圖4 雙雜交探針分子信標探針游離狀態下，分子信標探針是一種莖環結構，其環狀部分的15-30個堿基可以與靶標區域相結合匹配，下端的配對區域（左右一般各5-6個堿基）則由重復的GC組成，從而將5’的熒光分子和3’的淬滅基團緊緊聚在一起，熒光發生淬滅；當退火時，分子信標探針解開環并與模板靶標雜交，這樣熒光分子和淬滅基團的物理距離就變大了，熒光淬滅的前提就打破了（圖5）。除了MGB探針，分子信標探針也非常適合用于SNP檢測。▲ 圖5 分子信標探針除了上述幾種類型的探針之外，還有嘗試將引物和探針功能相結合的技術，如Amplifluor、LUX等，在設計難度上有所提高，但使用時更簡便。各有其應用的側重點和設計上的利弊，在此不多贅述。那么在熒光定量PCR實驗中，我們應該如何進行選擇呢？在這里，給大家總結了一些兩種方法的區別，供大家參考。表1 染料法和探針法的區別

2022-12-30 11:24:37MICA實現Caspase 3/7多色檢測: Caspases與細胞凋亡過程相關，因此可以利用caspase檢測來確定細胞是否正在經歷這種程序化的細胞死亡。這些檢測可以通過例如流式細胞儀、平板讀數儀實現，也可以在顯微鏡上完成，顯微鏡可為量化數據補充可見的結構信息。在這篇文章中，我們描述了MICA是如何用于caspase 3/7測定。借助Navigator或像素分類器等工具，MICA讓設置、執行和分析caspase 3/7檢測變得更加容易，即使沒有經驗的用戶也可輕松操作。圖像：雙色caspase檢測并進行拼接掃描。U2OS細胞用核標記物DRAQ5（品紅）和CellEvent?（黃色）標記。加入4mM星形孢菌素以誘導細胞凋亡。20倍物鏡下使用雙通道熒光，持續16小時每30分鐘獲取一次2x2 FOV（視野范圍）的掃描拼接圖像。引言凋亡細胞檢測或者活細胞/死細胞檢測一般通過將某種物質應用于活細胞并觀察細胞反應，以此檢測其毒性或有效性。死亡率隨時間推移而上升或者劑量依賴性上升均證明物質有效。判斷潛在藥物的抗癌效果便是一個典型示例。商用染料試劑盒可檢測處于凋亡狀態的細胞。這些試劑盒內染料為熒光染料，能夠分別標記活細胞和死亡細胞。Caspase活性檢測法是細胞凋亡檢測法的一種。Caspase（半胱天冬酶）是參與細胞凋亡過程的一類半胱氨酸蛋白水解酶。它們還用于區分caspase介導的細胞凋亡或細胞壞死。這里的染料試劑盒使用的是DNA結合試劑，該試劑的熒光能夠被四氨基酸肽(DEVD)阻斷。一旦caspase-3和caspase-7（caspase-3/7）被激活，即當細胞處于凋亡狀態時，caspase-3和caspase-7便會切割DEVD肽，然后DNA結合試劑便會開始呈現熒光。挑戰由于添加劑濃度不同、孵育時間不同、染色類型或者細胞系等參數的不同，實驗通常在多孔板上進行。這種方法有兩個優點，一是能夠在一個反應容器中設置多個不同的試驗條件，二是只需要極少量的試劑和極低數量的細胞。但是，在實施過程中，用戶仍然可能會被不同孔和不同實驗的數量混淆。設置多孔板實驗時，MICA自帶的Navigator工具能夠幫助預覽。包括可以在虛擬畫板上計劃并設置每一孔的掃描拼接實驗或者延時實驗（見圖1）。圖1：導航工具。Navigator能提供整個樣品載體的預覽（例如，玻片、培養皿、孔板），并幫助用戶設置實驗。用戶能夠在整個孔板上操作導航并進入單孔內，比如界定感興趣區域或者設計掃描拼接。追蹤細胞活動需要使單一熒光通道的時空相關性成像。傳統的寬場顯微鏡一般一次記錄一個通道，因此每一個細胞結構只能按順序、一個接一個地記錄下來。這意味著兩個不同的結構記錄于兩個不同的時間點。這對于極速發生的細胞事件來說可能會產生影響，特別是在共定位研究中。同時成像通過在同一時間記錄全部熒光的方法規避了這一缺點。對于caspase活性檢測法而言，這意味著用戶能夠觀察到，例如在caspase-3/7被激活的瞬間線粒體的反應。MICA能夠同時檢測四種熒光，使用戶可以同時觀察到除細胞核、caspase-3/7活性、線粒體等之外的另一個細胞結構（見圖5）。最后，如果想要確定某一特定試劑在誘導caspase介導細胞凋亡時的效果，則需要對caspase檢測進行量化。這種量化需要通過專門的外部軟件來實現。MICA自帶分析解決方案，不需要另外的軟件。通過MICA自帶的像素分類器，用戶能夠標記一些感興趣區域（ROI），人工智能算法可以訓練和識別這些區域（見圖2）。對于caspase活性檢測法而言，細胞核信號可用于確定細胞總數。CellEvent?信號可用于識別caspase介導的凋亡細胞。圖2：利用像素分類工具訓練MICA識別圖像中樣品特征。通過在圖像中標記示例特征，像素分類器能夠訓練和劃分所有目標物。方法在這一案例研究中， U2OS細胞或者COS7細胞被鋪在96孔板，然后培養一整晚的時間。在實驗過程中，活細胞分別用DRAQ5、SPY-650-DNA以及TMRE孵育15分鐘。之后，更換培養基，在實驗結束前使用CellEvent?孵育細胞。每孔內加入凋亡誘導劑星形孢菌素（3 μM–7 μM）。在四色caspase活性檢測法中，U2OS細胞被接種在96孔板上并在夜間生長，然后培養一整晚的時間。在實驗過程中，活細胞與DAPI和TMRE孵育45分鐘。之后，更換培養基，在實驗結束前使用CellEvent?和SiR-Tubulin孵育細胞。每孔內加入凋亡誘導劑—星形孢菌素（3 μM–7 μM）。在37℃、5% CO2和~65%濕度的環境中，按照指示的時間間隔和持續時間用MICA進行活細胞成像。使用Navigator工具設定并執行檢測。一些實驗中會運行掃描拼接（參見視頻2）。進行掃描拼接時，研究人員使用的主要策略是“focus Map”；此外，延時實驗通過“Keep focus”來保持細胞的聚焦。使用MICA自帶的分析功能進行本次實驗中的數據分析。其中核心組件之一便是人工智能驅動的像素分類器，該功能位于“Learn”選項。通過像素分類器，用戶能夠標記其感興趣區域（ROI），該區域將作為所有要檢測的其他區域的示例。如圖5所示，細胞核被像素分類器標記并檢測。像素分類器同樣能夠標記并檢測線粒體活性標識TMRE和caspase呈陽性的細胞。之后會在整個延時攝影過程中分析這批圖像。經過計算之后，MICA會將計算結果以散點圖、共定位圖、直方圖、餅狀圖、框圖或者時間序列圖的形式展示在“結果”選項中。圖3：在分析過程中，MICA會標記作為樣例的感興趣區域，為人工智能驅動的分析功能提供信息。在此檢測法中，細胞核（品紅）和caspase陽性細胞（綠色）會被用于訓練像素分類器，通過這種方式，像素處理器便有能力分析caspase介導的凋亡細胞比例。結果 SPY-650-DNA（標記細胞核）和CellEvent?（標記caspase 3/7活性）兩種細胞染料的量化研究揭示了在活細胞實驗中發生caspase介導的凋亡細胞。細胞核的數量說明了每張圖像中細胞的數量，可與處于凋亡過程中細胞的數量相對應。另一個標記，即TMRE成像過程，揭示了線粒體活性。量化數據(如長度、寬度、面積)顯示在采集圖像下方的表格中，這些數據可被導出為Excel表格。獲取的圖像可以在延時成像的每一個時間點上查看，并可以與識別的ROI重疊。三色caspase 3/7活性檢測圖（圖4）顯示，細胞核信號在開始的時候增強，之后逐漸減弱。信號增強是因為核染色劑必須與DNA結合，這一結合過程需要一定的時間。另一方面，SPY-650-DNA信號減弱是因為細胞核解體，解體現象見相關圖像。其他信號要么隨時間增加而增強（CellEvent?），要么隨時間增加而減弱（TMRE）：caspase介導的凋亡細胞數量增加的同時激活狀態的線粒體數量減少。圖4：三色caspase 3/7活性檢測法量化研究。通過像素分類器檢測細胞核、TMRE和caspase陽性細胞，以確定在不同濃度的星形孢菌素下，隨著時間的推移發生caspase介導的凋亡的細胞數量。TMRE信號能反映線粒體的健康狀態。結果可以多種形式展示，比如時間序列圖。用戶可以通過MICA一次性對四種熒光成像。在caspase 3/7活性檢測法中，這有助于調查凋亡過程中額外的細胞成分的命運—實現100%時空相關性。圖5中展示的案例顯示，除了細胞核（DAPI）、激活狀態的線粒體（TMRE）以及caspase陽性細胞（CellEvent?）以外，也對肌動蛋白細胞骨架（SiR-Actin）進行了染色。高倍率下（63x），用戶能夠看到，caspase被激活之后，肌動蛋白細胞骨架坍塌。與此同時細胞核以及線粒體停止工作。因為所有通道都是在一次拍攝中獲得的，各細胞活動成像之間存在精確聯系。圖5：四色caspase-3/7檢測，用SiR-Actin、TMRE（線粒體活性）、CellEvent?（caspase活性）以及DAPI（細胞核）標記U2OS細胞。在時間點0加入星形孢菌素。在63x高倍、寬場模式以及THUNDER（ICC）成像模式下獲得的圖像。結論Caspase活性檢測法為研究抗癌藥物提供了新的見解。為了實現這一目標，研究人員必須在保證高時空精準度的情況下將活細胞從凋亡細胞中區分出來。對于統計上可靠的結果，增加量很有必要。這就是為什么這類實驗必須在孔板上進行，也必須進行量化研究。MICA滿足以上全部要求。在FluoSync的幫助下，MICA可同時保證多達4種不同的熒光染料可以同時成像，不論是在單一培養皿上，還是在96孔板上。MICA完整的培養系統能夠培育活細胞數日，同時其自帶的基于人工智能的分析功能也有助于用戶獲得可靠的數據。參考：FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images, Science Lab, Leica Microsystems (leica-microsystems.com)

2021-01-06 09:46:43多色熒光原位雜交技術(M-FISH)的基本原理及應用: 熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization，FISH)是根據核酸堿基互補配對原理，用半抗原標記DNA或者RNA探針與經過變性的單鏈核酸序列互補配對，通過帶有熒光基團的抗體去識別半抗原進行檢測，或者用熒光基團對探針進行直接標記并與目標序列結合，利用熒光顯微鏡直接觀察目標序列在細胞核、染色體或切片組織中的分布情況。M-FISH則是在熒光原位雜交基礎上發展起來的新技術，它不僅具有FISH的優點，而且克服了FISH的許多局限，其特點是可將多次繁瑣的FISH實驗和多種不同的基因定位在一次FISH實驗中完成。M-FISH能同時檢測多個基因，分辨復雜的染色體易位和微小缺失，區分間期細胞多倍體和超二倍體等。M-FISH用激發光譜和吸收光譜不同的熒光索按一定調色方法標記不同的探針，從而對不同靶DNA同時進行定位和分析，并能對不同探針在染色體上的位置進行排序。探針熒光素顏色調配的方法有非調色法，混合調色法和比例調色法。這3種調色法中，比例調色法只需要幾種熒光素就可標記多種探針，因而更有發展潛力。染色體描繪、比較基因組雜交、光譜染色體自動核型分析、交叉核素色帶分析及多彩色原位啟動標記等技術都是在M-FISH的基礎上發展起來的。與其他原位雜交技術相比，多色熒光原位雜交具有很多優點，主要體現在：①宜于多靶雜交，可對同一個細胞學制片進行多個探針雜交；②通過在同一個核中顯示不同的顏色可一次性顯示全部的染色體數量或結構的變化；③能檢測到傳統顯帶方法不易發現的亞纖維染色體畸變不僅能夠鑒定隱藏的易位和復雜的重拍，而且可以分析與腫瘤發生相關的重要標記染色體及其基因。目前該項技術目前已廣泛應用于動植物基因組結構研究，染色體精細結構變異分析，病毒感染分析，微生態分析，腫瘤遺傳學和基因組進化研究等許多領域。明美MFISH熒光原位雜交分析系統就是一款專為熒光顯微圖像的捕捉和處理而開發的實用圖像軟件。它搭配不同波段光譜濾光片的熒光顯微鏡以及高靈敏度的相機可對多種探針信號進行檢測成像，還有區域自動曝光，自動著色，信號點增強，一鍵合成多色熒光通道圖像，自定義各種顏色的探針，多焦面信號景深疊加，多層圖像位置偏移較正等功能。深圳禾正醫院的老師采用了明美的MFISH熒光原位雜交分析系統，檢測中用her2/cep17的比值來測定是否有此原癌基因擴增，當HER2／CEP17比值≥2.0時，為HER2陽性；此外老師還定制了雙通道熒光模塊，可以同時在目鏡下觀察到紅綠兩種顏色的信號點，大大提高科室的工作效率。（來源：http://www.mshot.com/article/903.html 廣州市明美光電技術有限公司）

2021-12-23 10:16:13遇見“Prima”——德國PicoQuant全新推出多色激光器: 近日，在德國柏林最近的一次網絡研討會上，PicoQuant向大家展示了其最新的激光創新良心之作：獨立的、全電腦控制的激光模塊Prima。 PicoQuant公司的產品經理Guillaume Delpont闡述了這款激光器的設計初衷：“許多科研人員在工作中都面臨著同樣的困難，那就是他們需要多個激發波長來研究他們的待測樣品，而購買多個激光器又會變得非常昂貴。PicoQuant公司為了給科研人員面臨的共同挑戰提供解決方案，最終依托自身在激光開發方面長達25年的專業背景和研發實力，創造了Prima—— 一種經濟實惠、緊湊的激光模塊，可以發出紅色、綠色和藍色的脈沖激光。” Prima—三色皮秒脈沖激光器Prima是一款獨立、緊湊、價格合理的激光模塊，提供3個獨立的發射波長，可以在皮秒脈沖和連續波(CW)模式下工作。皮秒脈沖可以由Prima模塊的內部時鐘觸發，也支持高達200MHz的外部觸發。該模塊采用全電腦控制，操作非常簡單：通過USB端口將Prima連接到PC端，所有操作參數的更改都可以通過一個方便的軟件接口完成。紅、綠、藍：三種最有用的波長Prima可以提供三種波長的激光：640nm、515nm和450 nm。每種顏色都可以單獨輸出，每次輸出一個波長。這三種顏色是材料科學、化學和生命科學中最常用的3種波長，廣泛應用于光譜學或顯微鏡應用的常規激發，進行種類多樣待測樣品的研究，其中包括新型納米材料、量子點、分子和熒光團。 Prima是一款幾近完美的工具：當涉及到日常實驗室任務時，能夠滿足您的大多數需求，如壽命或量子產率測量，光致發光和熒光測量等。靈活多樣的工作模式：脈沖、連續和快速開關模式在進行時間分辨或穩態測量的時候，無論您需要哪種類型的操作模式，Prima的靈活性都可以輕松實現。Prima同時也支持快速連續開關功能。脈沖模式支持內觸發和外觸發，內觸發的重頻率范圍從100 Hz至200 MHz可調，外觸發支持的重復頻率范圍從單次脈沖至200 MHz。每個波長的平均輸出功率高達5mW。在CW工作模式下，每個波長可以達到更高的平均輸出功率(高達50 mW)。在CW工作模式下，進行ON和OFF狀態切換的上升/下降時間小于3 ns。恒定的重復頻率可以通過內部觸發來進行設置，Burst工作模式也可以由合適的外部觸發源實現觸發(例如，PicoQuant的Sepia PDL 828的振蕩器模塊)。您甚至可以將Prima與其他激光模塊組合使用，從而實現更為復雜的激發模式，不僅包括Burst模式，還包括脈沖交替激發(PIE)或交替激光激發(ALEX)。這使得Prima成為一個通用的工具，可以在許多環境中使用。易于使用作為一個獨立的激光模塊，Prima不需要任何其他外部激光驅動對齊進行控制。其參數設置和操作通過一個基于成熟的Sepia的圖形用戶界面軟件進行全電腦控制。

2023-05-08 19:13:14明美LED熒光光源助力顯微鏡熒光升級: 明美LED熒光光源助力顯微鏡熒光升級熒光顯微鏡具有特異性強、檢出率高等優勢，因此在各種科研和醫學檢查應用中使用廣泛，傳統熒光顯微鏡因為汞燈光源限制，有比較多使用難點，明美針對這些問題，投入大量人力和資金，研發出了一系列LED熒光光源，助力顯微鏡熒光升級和傳統熒光顯微鏡升級LED熒光顯微鏡，取得市場廣泛認可。熒光顯微鏡的常用光源通常都是白光光源，而熒光光源有高壓汞燈，氙燈，金屬鹵素燈和LED白光光源以及LED單波長光源，光源間各有優劣勢，近期，北京用戶需要替換汞燈光源，因為汞燈壽命短，需預熱，操作繁瑣，明美北京區域工程師提供了四通道的LED熒光光源MG-120，壽命長，即開即關，操作簡單，解決的老師的使用煩惱熒光光源MG-120采用四通道獨立控制，可選BGUR等不同通道配置，壽命長，衰減慢，通常不需要更換燈泡及校準，可以即開即用；控制方便，外部配備有控制器，能進行特定波長開關和亮度記憶，減少熒光串色及熒光淬滅。此次，用戶是搭配奧林巴斯倒置顯微鏡IX73，該熒光光源已做測試，可適配各熒光顯微鏡如果您對熒光光源感興趣或存在疑問，歡迎與我們聯系，我們將竭誠為您服務！來源：https://www.mshot.com/article/1738.html