臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有較高的分化潛能，可向多個(gè)方向進(jìn)行分化。它在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。有報(bào)道從人臍帶中分離出MSCs，且細(xì)胞含量、增殖能力優(yōu)于MSCs，免疫原性比MSCs低  ，并且具有取材方便，無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，因此越來(lái)越受到研究工作者們的關(guān)注。

近期有位客戶需要一臺(tái)顯微鏡用于觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，由于它是需要培養(yǎng)皿培養(yǎng)的，因此銷售經(jīng)理推薦細(xì)胞工廠顯微鏡MI52-CF。

 
顯微鏡MI52-CF觀察臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

細(xì)胞工廠MI52-CF采用優(yōu)良的無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)明視場(chǎng)、相襯觀察。可對(duì)高培養(yǎng)皿或圓筒狀燒瓶進(jìn)行無(wú)沾染培養(yǎng)細(xì)胞觀察。或?qū)?xì)胞組織，透明液態(tài)組織的顯微觀察，可對(duì)培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)顯微觀察，也可對(duì)“細(xì)胞工廠”進(jìn)行顯微觀察。可應(yīng)用于科研院所、高等院校、醫(yī)療衛(wèi)生、生物醫(yī)藥、檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)牧乳業(yè)等部門。

除此之外，熒光顯微鏡也可應(yīng)用于人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞主庫(kù)支原體

熒光生物顯微鏡MF31-M采用無(wú)限遠(yuǎn)平場(chǎng)消色差物鏡和大視野目鏡，可用雙目或三目觀察，搭配LED熒光激發(fā)裝置，實(shí)現(xiàn)明場(chǎng)和熒光顯微觀察，供臨床試驗(yàn)室利用顯微放大原理觀察微小細(xì)胞、組織等樣本用。

如果您對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞顯微鏡感興趣或有疑問(wèn)，歡迎與我們聯(lián)系，期待與您相約！

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基因工程細(xì)胞的同質(zhì)性對(duì)于很多應(yīng)用都是必要條件，例如細(xì)胞株開發(fā)、基因ZL、組織工程以及細(xì)胞ZL與再生醫(yī)學(xué)。CRISPR/Cas9基因編輯存在脫靶等情況，無(wú)法直接得到均質(zhì)的細(xì)胞，因此需要開展單細(xì)胞克隆，之后才能用于臨床。

CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)（CloneSelect Single Cell Printer）采用類似噴墨打印的技術(shù)，柔和地產(chǎn)生包裹細(xì)胞的液滴無(wú)接觸地直接分配到微孔板中（圖1）。同時(shí)，該系統(tǒng)借助智能圖像分析，確認(rèn)細(xì)胞數(shù)目，分析細(xì)胞的形態(tài)（大小和圓度）及熒光強(qiáng)度，聯(lián)動(dòng)的真空裝置將不符合要求的液滴（如空液滴或者含多個(gè)細(xì)胞的液滴）直接吸走，而符合要求的細(xì)胞液滴則分配至微孔板，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的分選和接種。單細(xì)胞分離系統(tǒng)是一種可比移液器操作的柔和的單細(xì)胞分離技術(shù)，而流式分選由于高的液體剪切力和電壓的影響，會(huì)降低敏感細(xì)胞和部分受損細(xì)胞（如電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞）的成克隆率，因此單細(xì)胞分離系統(tǒng)更適用于基因工程細(xì)胞的克隆，維持細(xì)胞活力，并提供直接的單克隆性圖像證據(jù)。

圖1：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)

最近發(fā)表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）開展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程起始于轉(zhuǎn)染，接著用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)開展單細(xì)胞克隆，隨后在DNA、RNA以及蛋白質(zhì)水平開展分析，ZH開展細(xì)胞功能分析（圖2）。

圖2：基因編輯間充質(zhì)干細(xì)胞的單細(xì)胞克隆及分析流程。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒中加入了GFP基因，轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞后，用具備熒光分選功能的CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選出轉(zhuǎn)染成功的單細(xì)胞。系統(tǒng)可設(shè)定細(xì)胞直徑、圓度和熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，分選出單個(gè)活細(xì)胞并接種至微孔板。圖3為系統(tǒng)分選基因編輯的間充質(zhì)干細(xì)胞的5張連續(xù)的圖像。通過(guò)瀏覽單細(xì)胞分離過(guò)程中記錄的5張連續(xù)的圖像，作者統(tǒng)計(jì)單細(xì)胞接種的成功率為93.9±2.7%（n=451），即僅有~6%的孔為多細(xì)胞孔，或空孔或無(wú)法確認(rèn)（圖4）。這一結(jié)果表明f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)可以準(zhǔn)確地識(shí)別細(xì)胞并成功將其接種至微孔內(nèi)。

圖3：CloneSelect f.sight系統(tǒng)分選間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)采集的5張連續(xù)圖像，可用于證明單克隆性。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)¹）。

除了帶GFP的基因敲除質(zhì)粒外，作者還將pmaxGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至間充質(zhì)干細(xì)胞作為對(duì)照用于評(píng)估單細(xì)胞分離效率和克隆率。此外，作者轉(zhuǎn)染了多個(gè)不同的基因敲除質(zhì)粒。雖然不同的質(zhì)粒因?yàn)榇笮〔煌尸F(xiàn)各異的轉(zhuǎn)染效率，但是成克隆率都達(dá)到了30%。此外，作者還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的間充質(zhì)干細(xì)胞（31.3±8%）和未轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差異較小，這也表明f.sight的單細(xì)胞分選過(guò)程柔和，因此產(chǎn)生的系統(tǒng)偏差較小（圖4）。

圖4：CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)的高接種效率（左）和高成克隆率（右）。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)¹）。

接著作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分別從DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平對(duì)基因編輯后的間充質(zhì)單細(xì)胞開展分析。ZH作者選出一株雙等位基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）檢測(cè)其成骨分化的能力，并以未編輯的MSC為對(duì)照開展平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成骨分化培養(yǎng)基后，分別在第7天、14天和21天用茜素紅染色。在第14天，細(xì)胞失去細(xì)長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，開始呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞樣的形態(tài)，然后在第21天開始出現(xiàn)鈣沉積，發(fā)展過(guò)程與親本的MSC對(duì)照類似（圖5）。這表明基因編輯后的MSC其成骨分化能力并沒(méi)有因?yàn)榛蚓庉嫼秃Y選過(guò)程而受到影響。

圖5：RANKL基因敲除的間充質(zhì)干細(xì)胞（g23d）和親本間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和成骨分化。（圖片來(lái)源：文獻(xiàn)1）。

在這個(gè)研究中，作者搭建了一整套實(shí)驗(yàn)流程，起始于CRISPR/Cas9基因編輯，單細(xì)胞克隆以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)各個(gè)水平的分析和細(xì)胞功能測(cè)試。實(shí)驗(yàn)流程中采用CloneSelect f.sight單細(xì)胞分離系統(tǒng)成功GX地分選出基因編輯后帶GFP的間充質(zhì)干細(xì)胞。單細(xì)胞接種效率高達(dá)93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高達(dá)31.3% (±8%)。相比傳統(tǒng)的有限稀釋法和流式分選，CloneSelect單細(xì)胞分離系統(tǒng)具有GX率，高活率，操作簡(jiǎn)單，單克隆性證據(jù)充分等優(yōu)勢(shì)，是基因工程細(xì)胞克隆的理想工具。