氨基酸作為構(gòu)成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類(lèi)化合物。
隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質(zhì)量分析的需求也越來(lái)越大。
大部分氨基酸由于至少同時(shí)含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動(dòng)相對(duì)其保留很弱，同時(shí)部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動(dòng)相和檢測(cè)器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結(jié)廣州菲羅門(mén)積累經(jīng)典色譜應(yīng)用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析四種廣受關(guān)注的應(yīng)用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過(guò)程相對(duì)繁瑣，但是通過(guò)衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個(gè)難點(diǎn)：
保留和紫外吸收。
通過(guò)衍生反應(yīng)在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)在C18柱+反相流動(dòng)相的體系下進(jìn)行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當(dāng)選擇氨基酸非衍生直接分析時(shí)，對(duì)于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類(lèi)柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實(shí)現(xiàn)保留，當(dāng)使用磷酸鹽類(lèi)時(shí)，可以在截止波長(zhǎng)條件下用UV檢測(cè)，比較經(jīng)典的應(yīng)用是用ACE HILIC-B檢測(cè)門(mén)鳥(niǎo)氨酸：

菲羅門(mén)也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者M(jìn)S為檢測(cè)器的條件下分析氨基酸。

三、保護(hù)型氨基酸手性分析

當(dāng)氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護(hù)起來(lái)時(shí)，可以用正相或者反相的多糖類(lèi)手性柱實(shí)現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開(kāi)發(fā)的時(shí)間。

四、非保護(hù)氨基酸直接手性分析

對(duì)于非保護(hù)的氨基酸，菲羅門(mén)推出AAOA分析柱，即通過(guò)鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機(jī)酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內(nèi)酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實(shí)現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門(mén)冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結(jié): 本文全面總結(jié)了氨基酸類(lèi)的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析。

對(duì)于具體氨基酸的分析如有疑問(wèn)，可以電話(huà)020-22826668找到您專(zhuān)屬的技術(shù)工程師。

氨基酸作為構(gòu)成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類(lèi)化合物。

隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質(zhì)量分析的需求也越來(lái)越大。
大部分氨基酸由于至少同時(shí)含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動(dòng)相對(duì)其保留很弱，同時(shí)部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動(dòng)相和檢測(cè)器的選擇更有挑戰(zhàn)。

本文系統(tǒng)總結(jié)廣州菲羅門(mén)積累經(jīng)典色譜應(yīng)用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析四種廣受關(guān)注的應(yīng)用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過(guò)程相對(duì)繁瑣，但是通過(guò)衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個(gè)難點(diǎn)：
保留和紫外吸收。
通過(guò)衍生反應(yīng)在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)在C18柱+反相流動(dòng)相的體系下進(jìn)行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當(dāng)選擇氨基酸非衍生直接分析時(shí)，對(duì)于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類(lèi)柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實(shí)現(xiàn)保留，當(dāng)使用磷酸鹽類(lèi)時(shí)，可以在截止波長(zhǎng)條件下用UV檢測(cè)，比較經(jīng)典的應(yīng)用是用ACE HILIC-B檢測(cè)門(mén)鳥(niǎo)氨酸：

菲羅門(mén)也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者M(jìn)S為檢測(cè)器的條件下分析氨基酸。

三、保護(hù)型氨基酸手性分析

當(dāng)氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護(hù)起來(lái)時(shí)，可以用正相或者反相的多糖類(lèi)手性柱實(shí)現(xiàn)非常好的分離，有現(xiàn)成的分析方法，可以極大地減少方法開(kāi)發(fā)的時(shí)間。

四、非保護(hù)氨基酸直接手性分析

對(duì)于非保護(hù)的氨基酸，菲羅門(mén)推出AAOA分析柱，即通過(guò)鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機(jī)酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內(nèi)酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了有機(jī)酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實(shí)現(xiàn)了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門(mén)冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結(jié): 本文全面總結(jié)了氨基酸類(lèi)的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護(hù)型氨基酸的手性分析以及非保護(hù)型氨基酸直接手性分析。

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菲羅門(mén)色譜柱選擇卡

菲羅門(mén)與ACE色譜柱的保養(yǎng)方法

色譜柱是一種消耗品，因此使用壽命有限。

對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，色譜柱應(yīng)持續(xù)進(jìn)行500-2000次注射（進(jìn)樣），但這會(huì)因樣品的清潔度、流動(dòng)相的pH值和保護(hù)柱卡套的使用（是否使用保護(hù)柱）而不同。

這里列出的做法有助于Z大限度地提高硅基（硅膠基質(zhì)）色譜柱的使用壽命。

一、色譜柱的平衡：當(dāng)從一個(gè)流動(dòng)相更換為另一個(gè)流動(dòng)相時(shí)，或者在回收梯度（梯度循環(huán)）時(shí)，應(yīng)需要10-20個(gè)柱體積。

下表顯示了各種色譜柱尺寸（規(guī)格）的色譜柱體積。

如果溶劑的變化不太劇烈（例如80％至20％的ACN/水與ACN至THF（與之相對(duì)的由ACN至THF）），則需要的體積較少。

檢查平衡Z簡(jiǎn)單方法是進(jìn)行兩次樣品注射。

如果保留相同，則色譜柱充分平衡；如果保留變化，應(yīng)增加平衡體積并重新試驗(yàn)。平衡與溶劑的體積有關(guān)，與時(shí)間無(wú)關(guān)。

所以較高的流量（流速）可以減少平衡時(shí)間。

                                        近似的色譜柱容量（mL）

二、色譜柱沖洗是一個(gè)簡(jiǎn)單的過(guò)程，可以通過(guò)清洗色譜柱中的頑固（保留較強(qiáng)的）物質(zhì)來(lái)延長(zhǎng)色譜柱的壽命。

每天結(jié)束色譜柱的使用時(shí)，應(yīng)除去一切緩沖液（應(yīng)除去色譜柱中的緩沖鹽），然后用100％強(qiáng)溶劑（通常為ACN或MeOH，采用反相方法）沖洗色譜柱。

下一頁(yè)列出的詳細(xì)沖洗程序可以有效恢復(fù)色譜柱的性能，但應(yīng)牢記：色譜柱是一種消耗品，因此請(qǐng)勿期望它能夠永遠(yuǎn)的持續(xù)使用！

避免用100％的水沖洗反相色譜柱（嵌入極性基團(tuán)或“AQ”色譜柱除外），因?yàn)橄啵ü潭ㄏ啵┤駮?huì)影響清洗效果，而且流動(dòng)相色譜柱的重新平衡會(huì)非常緩慢。

對(duì)于您的色譜柱，請(qǐng)按照以下所述的一般步驟，使用特定溶劑進(jìn)行色譜柱沖洗。

應(yīng)在沖洗之前查看制造商的建議（生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)），以免損壞色譜柱。
1. 拆掉并翻轉(zhuǎn)色譜柱（拆下色譜并反接）
2. 將色譜柱連接到泵上，而非檢測(cè)器（不接檢測(cè)器）
3. 用10-20個(gè)柱體積的溶劑進(jìn)行沖洗，且流速不得高于QC色譜圖的流速
4. 如果改變以下步驟，應(yīng)確保在每個(gè)連續(xù)步驟中使用可混溶溶劑（溶劑可互溶）

反相色譜柱（C18，C8，C4，苯基，CN，'AQ'型）
a. 流動(dòng)相無(wú)緩沖液
b. MeOH或ACN

如果金屬離子被認(rèn)為是污染的致因，應(yīng)使用0.05M EDTA水溶液沖洗，然后用水沖洗，并按上述順序沖洗。使用離子對(duì)試劑的色譜柱應(yīng)專(zhuān)門(mén)用于離子對(duì)的應(yīng)用之中。

未鍵合的硅膠柱（SIL）
a. IPA
b. MeOH
c. 乙酸乙酯

鍵合正相柱（CN、NH 2、二醇）
a. 三氯jia烷
b. IPA
c. 二氯jia烷
d. 己烷

陰離子交換柱（SAX，WAX）
a. 水
b. 甲醇
c. 三氯jia烷
d. 甲醇
e. 水

陽(yáng)離子交換柱（SCX，WCX）
a. 水（沖洗時(shí)注入4x200L的DMSO）
b. THF

蛋白質(zhì)的體積排阻柱
對(duì)于弱保留的蛋白質(zhì)
a. 0.1M磷酸鹽緩沖液，pH為3
對(duì)于強(qiáng)保留的蛋白質(zhì)
a. 100％水至100％ACN的梯度，運(yùn)行60分鐘

三、色譜柱的合理存放有助于延長(zhǎng)柱的使用壽命。

Z簡(jiǎn)單的存放步驟為：從柱中除去一切緩沖液，然后用10-20個(gè)柱體積的強(qiáng)流動(dòng)相溶劑（例如用于反相的MeOH或ACN）清洗柱，以除去柱中的頑固（強(qiáng)保留）物質(zhì)。

然后用制造商指定的存儲(chǔ)流動(dòng)相，以10-20個(gè)柱體積的容量沖洗色譜柱（該信息應(yīng)隨色譜柱提供，并在QC檢測(cè)色譜圖中進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明）。

Z后，安全地蓋上柱帽（擰緊堵頭），以防流動(dòng)相蒸發(fā)。
除了色譜柱制造商明確建議的特定情況（例如一些離子交換柱）外，請(qǐng)勿使用緩沖液或者少于約25％的有機(jī)溶劑來(lái)用于儲(chǔ)色譜柱存儲(chǔ)，因?yàn)樗鼈儠?huì)導(dǎo)致微生物的滋生。（保存色譜柱，以防微生物的滋生）

由廣東省藥學(xué)會(huì)策劃執(zhí)行的2019第二屆藥物雜質(zhì)分析分離學(xué)術(shù)研討會(huì)在廣州圓滿(mǎn)召開(kāi)。

本次會(huì)議得到了廣州菲羅門(mén)、暨南大學(xué)、華南師范大學(xué)、島津、研創(chuàng)、等有關(guān)單位的大力支持，為期兩天的論壇共吸引行業(yè)人員300余人參加。

其次，還對(duì)藥物中《基因毒雜質(zhì)的分析》等有關(guān)話(huà)題分享了經(jīng)驗(yàn)心得，就制藥行業(yè)實(shí)驗(yàn)的發(fā)展與形勢(shì)展開(kāi)探討，同時(shí)提出了色譜分析環(huán)節(jié)中的重要性以及實(shí)踐戰(zhàn)略與技術(shù)方案。

核苷酸專(zhuān)用柱是什么柱？菲羅門(mén)為您解答

核酸堿基、核苷和核苷酸的HPLC分析

核苷是由含氮堿基與核糖或脫氧核糖縮合而成，核苷與磷酸合成核苷酸。核苷酸主要參與構(gòu)成核酸，在人體內(nèi)廣泛分布，具有多種生物學(xué)功能，如與能量代謝有關(guān)的三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等。

為滿(mǎn)足不同物質(zhì)的分離要求，菲羅門(mén)推薦多款色譜柱對(duì)其進(jìn)行HPLC分析。

一、 核苷異構(gòu)體的分離

1.β-胸苷（dT）與α-胸苷的分離

ACE C18-AR是一種獨(dú)特的C18鍵合的HPLC色譜柱，結(jié)合了C18烷基鏈的疏水作用和苯基的芳香選擇性，而且可以耐水相，非常適合芳香化合物的分離。

色譜條件：

色譜柱ACE Excel C18-AR 5μ 150 × 4.6 mm

貨號(hào)：EXL-129-1546U

2.尿苷和阿糖尿苷的分離

ACE C18-Amide是一款嵌入極性酰胺基團(tuán)的C18柱，相當(dāng)于同時(shí)具備C18與酰胺基的選擇性，同樣耐水相，很適合分析含氫鍵給體的物質(zhì)。

色譜柱：ACE Excel C18-Amide 3μ 100 X 4.6 mm

貨號(hào)：EXL-1112-1046U

二、 核酸堿基和核苷的分析

ACE HILIC-N是ACE三款親水作用色譜柱中的中性柱，相對(duì)于陰陽(yáng)離子都顯示出較低的離子交換能力，通過(guò)極性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）來(lái)保留分離核酸堿基、核糖核苷和脫氧核糖核苷。

色譜柱：ACE HILIC-N 5μ 150 X 4.6 mm

貨號(hào)：HILN-5-1546U

三、 核酸堿基、核苷和核苷酸的分析

Titank C18有機(jī)硅膠雜化色譜柱，是在硅膠的硅氧網(wǎng)狀構(gòu)造中以更加穩(wěn)定的烷基來(lái)取代在堿性條件下不穩(wěn)定的硅氧橋連接，具有寬pH耐受范圍（1-12）、低背壓和水相穩(wěn)定的特點(diǎn)，對(duì)于較大極性的物質(zhì)有很好的保留。

色譜柱：菲羅門(mén) Titank C18 3μ 50 × 3.0mm

貨號(hào)：FMB-5559-YONU

四、 單磷酸核苷酸的分離

ACE NH2是氨丙基鍵合的硅膠柱，與ACE其它固定相的色譜柱一樣，都是采用超惰性的硅膠制成，具有很好的穩(wěn)定性和使用壽命。

色譜柱：ACE Excel 3μ NH2

貨號(hào)：EXL-1114-1546U

五、 九種核苷酸的分離

Comixshell AIRP是陽(yáng)離子嵌入烷基鍵合的核殼硅膠柱，同時(shí)具有反相和陰離子交換選擇性，是Comix系列色譜柱中的一種。

Comix系列色譜柱可以用來(lái)同時(shí)檢測(cè)無(wú)機(jī)和有機(jī)化合物、分離大極性物質(zhì)及復(fù)雜體系。

色譜柱：菲羅門(mén) Comixshell AIRP 2.7μ 150 × 4.6 mm

貨號(hào)：FMF-AIRP-EONU

總之，不同的疏水性或是極性作用力的固定相可以提供不同的選擇性，所以選擇正確的固定相是至關(guān)重要的一步。

        誤區(qū)1：HPLC 柱不可以反沖

        這是不正確的。通常情況下液相色譜柱所設(shè)計(jì)的耐壓值是遠(yuǎn)高于最da操作壓力的。換柱時(shí)反沖可以清洗柱頭一些具有強(qiáng)吸附性質(zhì)的物質(zhì)，我們沖洗出這些殘留物質(zhì)也是為了防止壓力增大。但是如果你購(gòu)買(mǎi)的色譜柱在柱頭使用了大粒度的填料，這時(shí)你反沖會(huì)沖出這一部分填料。因此你要先檢查一下自己使用的液相色譜柱再選擇是否反沖。

        誤區(qū)2：所有的C18（L1）色譜柱都是一樣的

        這是不正確的。在早期的HPLC體系中，C18是唯yi反向色譜的鍵合固定相，因此C18就作為了反向色譜柱的標(biāo)準(zhǔn)。但是時(shí)代不會(huì)一直停滯腳步，人們對(duì)于科學(xué)的追求與理解愈發(fā)深刻，更多的固定相出現(xiàn)了，誕生了許多C18色譜柱。雖然同樣是選用硅膠作為基體，但各自都有自己特定的填料鍵合合成工藝，因此色譜性能也不相同。所以單純的因?yàn)槊Q(chēng)都是C18色譜柱，想當(dāng)然覺(jué)得性能都一樣是不對(duì)的。

        誤區(qū)3：色譜柱里一旦進(jìn)入空氣就會(huì)損壞

        我們都知道當(dāng)色譜柱不與色譜儀連接的時(shí)候，需確保色譜柱被緊緊地密封。但是在實(shí)際應(yīng)用中，即使色譜柱的端部進(jìn)入了少量的空氣也不是很?chē)?yán)重的事情。當(dāng)色譜柱連接到色譜儀上使用時(shí)，在系統(tǒng)初始加壓階段，在很短的時(shí)間內(nèi)空氣就會(huì)被溶劑擠壓排出。所以，不要因?yàn)樯V柱進(jìn)入了少量空氣就認(rèn)為色譜柱已被損壞。

        誤區(qū)4：保護(hù)柱是沒(méi)必要的

        這也是太JD的誤區(qū)，其實(shí)使用保護(hù)柱有很多好處。HPLC的移動(dòng)相中常使用各種試劑，其中會(huì)混有一些不溶解物質(zhì)或不純物質(zhì)。多數(shù)不溶物通過(guò)使用篩板或膜濾器過(guò)濾移動(dòng)相可以除去，但極細(xì)小的粒子還是無(wú)法完全過(guò)濾。此外在移動(dòng)相調(diào)制之后，還有通過(guò)空氣、容器、人體等有不溶物、不純物落入的可能性。這些不溶物、不純物質(zhì)會(huì)污染柱、或使堵塞、或給分析帶來(lái)不良影響等。這時(shí)通過(guò)在色譜柱前安裝分析保護(hù)柱可以防止其產(chǎn)生，能起保護(hù)色譜柱的作用。相較于更換一根昂貴的分析柱，添加或更換保護(hù)柱只需要很少的花費(fèi)。恒譜生液相色譜保護(hù)柱幾乎無(wú)死體積、便于更換，適用于UHPLC系統(tǒng)的高壓，將那些強(qiáng)保留的、不可吸附的化合物截留下來(lái)。樣品和流動(dòng)相的過(guò)濾可以維護(hù)保護(hù)柱對(duì)化學(xué)污染物的吸附容量，能夠更長(zhǎng)時(shí)間的維護(hù)柱效，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命。

        誤區(qū)5：反相色譜柱不可以使用純水相

        這也是不正確的，有些色譜工作者在使用低有機(jī)溶劑含量或者純水作為反相色譜柱的流動(dòng)相時(shí)，發(fā)生相塌陷的現(xiàn)象，所以有些人認(rèn)為反相色譜柱不可以使用純水相。但事實(shí)上市場(chǎng)上銷(xiāo)售的反相色譜柱（如極性嵌入和極性封端柱）都是具有水浸潤(rùn)性的，其表面特性是允許使用純水的，不會(huì)導(dǎo)致塌陷或者保留時(shí)間移位。

        誤區(qū)6：色譜柱填料粒徑越小、壓力越高，分離效果越好

　　色譜柱性能的好壞不能單純用填料是否是超小的粒徑以及超高的柱壓來(lái)評(píng)估。現(xiàn)代對(duì)于色譜柱的柱特性研究越來(lái)越深入，已經(jīng)研發(fā)了一些能夠提高色譜柱柱效的方法。例如，采用新的表面多孔材料的色譜柱，其柱效與sub-2μm UHPLC柱效一樣好，與常規(guī)的LC填料色譜柱比起來(lái)，柱壓很低。

　　誤區(qū)7：柱壓不會(huì)影響色譜分離效果

        近年來(lái)，柱壓的問(wèn)題引起了很多色譜工作者的注意，柱壓是色譜的很多參數(shù)都是受柱壓影響的，包括部分溶質(zhì)的摩爾體積、停滯體積、柱孔隙度、保留因子、流動(dòng)相密度、介電常數(shù)、固定相結(jié)構(gòu)、pH值和電離常數(shù)等。當(dāng)色譜柱在約2000psi（13.789MPa）壓力下運(yùn)行時(shí)，即使保留時(shí)間上存在小差異，也并不會(huì)引起我們的注意；特別是如果重復(fù)性較好及定量不受影響的時(shí)候。但是，當(dāng)柱壓接近2000psi（13.789MPa）時(shí)，柱壓的影響可能就相當(dāng)明顯了。

        近幾十年來(lái)，液相色譜法被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域，藥物分析，食品分析，環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，人們對(duì)于液相色譜法的不斷研究，也誕生出更多的液相色譜應(yīng)用以及解決方法等，相信未來(lái)液相色譜法的應(yīng)用領(lǐng)域會(huì)更加廣闊。

1.利用ACE鍵合相的固定相選擇

分離度方程式可以確定影響分離度的參數(shù)：柱效（N）、容量因子（k）和選擇性（α）。

在過(guò)去幾年里，柱效和使用超GX色譜柱（被稱(chēng)為“UHPLC”色譜柱）作為實(shí)現(xiàn)分離目標(biāo)的手段已得到了極大的重視。

UHPLC已通過(guò)更快速的分離和更快速的方法開(kāi)發(fā)提高實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)力來(lái)證明了其價(jià)值。

然而，選擇性往往被忽視，且其重要性也被強(qiáng)調(diào)柱效所掩蓋。這是令人遺憾的。

在影響分離度的三個(gè)參數(shù)中，選擇性是Z為重要的。

（參見(jiàn)圖1）通過(guò)利用柱效和選擇性，通常可以實(shí)現(xiàn)更好和更快的分離。

圖 1：N、α和k對(duì)分離度（Rs）的影響

提高N，α或k可以提高分離度（Rs）。

然而，從這些圖中可以看出，隨著N或k值的提高，對(duì)分離度的改善效果也逐漸降低。

另一方面，提高選擇性（α）則沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題，因此其成為開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)的Z佳優(yōu)化變量。

在反相色譜中，固定相與分析物之間存在多種相互作用的機(jī)制，這可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離。

這些相互作用機(jī)制包括：疏水性結(jié)合、π-π、氫鍵、偶極-偶極和形狀選擇性。

不同類(lèi)型的鍵合相將提供其中一種或多種相互作用機(jī)制。表1列出了ACE鍵合相和每種可能的主要相互作用機(jī)制，這取決于分析物和流動(dòng)相條件。

表1: 比較不同鍵合相的分離機(jī)制/相互作用                                                                                  

利用鍵合相的選擇性實(shí)現(xiàn)更好的分離。
圖2表明了兩種ACE鍵合相即C18-AR與苯基之間的選擇性差異。
盡管兩種鍵合相提供了強(qiáng)π-π和偶極-偶極相互作用的可能性，但是在其它可能的相互作用機(jī)制（特別是疏水性結(jié)合）的強(qiáng)度方面，它們存在顯著差異。

C18-AR可能具有其它不同的分離機(jī)制，可以為復(fù)雜的混合物帶來(lái)更好的分離效果。對(duì)于其他混合物，可能不是這種情況，這是ACE鍵合相的優(yōu)勢(shì)。

當(dāng)開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)，ACE鍵合相可以提供各種可供選擇的重要保留機(jī)制。

非常強(qiáng)大且獨(dú)特的C18-AR和C18-PFP相只有在ACE和ACE Excel色譜柱中可以獲得。
通過(guò)利用柱效和選擇性，可以實(shí)現(xiàn)更好的分離。

圖 2：C18-AR與苯基相之間選擇性差異的比較

色譜柱尺寸： 50 x 2.1 mm, 3 μm
流動(dòng)相：

A= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于水中）；
B= 20mM KH2PO4,pH 2.7（溶于甲醇/水中：65:35, v/v）
流速： 0.6 mL/min
溫度： 60 ℃
檢測(cè)： UV 214 nm
梯度： 5分鐘內(nèi)從3至B，并持續(xù)1分鐘。

樣品：
1. 甲硝唑
2. 3-羥基苯甲酸
3. 苯酚
4. 苯甲醇
5. 咖啡茵
6. 水楊酸
7. 喹喔啉
8. 苯甲酸
9. 奎寧
10. 非那西丁
11. 1,4-二硝基苯
12. 1,3,5-三硝基苯
13. 呋塞米
14. 1,3,5 -三甲氧基苯
15. 吡羅昔康
16. 卡維地洛
17. 苯甲酸乙酯
18. 去甲替林

C18-AR相的疏水性更大，這可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更多的保留值和更佳的選擇性。還要注意C18-AR與苯基相的洗脫順序有很多變化。

圖3給出了鍵合相選擇能力的另一實(shí)例。

一個(gè)分離是用C18鍵合相的UHPLC色譜柱完成，另一個(gè)分離是用C18-PFP鍵合相的UHPLC色譜柱完成。

C18-PFP鍵合相提供的額外分離機(jī)制，使得總體分離效果更佳出色。

圖 3：ACE Excel可以獲得zhuo越的分離度和峰形：藥物及其相關(guān)物質(zhì)的UHPLC結(jié)果

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
流動(dòng)相：

A = 5mM甲酸（溶于水中）
B = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
梯度：5分鐘內(nèi)從3至B
流速：0.6 mL/min
溫度：40 ℃
檢測(cè)：UV 254 nm

樣品
1. 對(duì)乙酰氨基酚
2. 氫氯噻嗪
3. 甲基苯基亞砜
4. 甲基苯砜

在C18 UHPLC色譜柱和C18-PFP色譜柱上同樣快速地產(chǎn)生色譜圖。

然而，C18-PFP色譜柱可以為色譜峰對(duì)（13,14）和（15,17）提供更佳的選擇性，因此能夠提供優(yōu)越的總體分離性能。

2.ACE和ACE Excel硅膠基質(zhì)固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離的不利影響，并且在為堿性化合物提供zhuo越峰形方面贏得了口碑。  

峰拖尾可以降低分離度，降低靈敏度，甚至干擾準(zhǔn)確度和精密度（圖4）。  

峰拖尾有許多潛在的原因，但分離堿性物質(zhì)時(shí)的主要原因是硅膠固定相載體顆粒表面上的酸性硅醇基與分析物上的氨基之間的相互作用（圖5）。  

圖 4：峰拖尾對(duì)分離度和靈敏度的影響  

隨著峰拖尾（Tf，拖尾因子）從1.0增加到2.0，分離度（Rs）從1.5下降到0.87。  

由于峰寬增加以及峰面積保持不變，靈敏度（峰高）也隨著峰拖尾的增加而下降。  

ACE色譜柱采用具有極低硅醇活性的超惰性硅膠制成。  

這種超純硅膠采用ZL技術(shù)進(jìn)行有效鍵合和徹底封尾。  

導(dǎo)致這種硅膠基質(zhì)的固定相幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離的不利影響。  

ACE色譜柱的超惰性特性使其成為分離極性堿性化合物的理想選擇。  

當(dāng)分離復(fù)雜堿性化合物時(shí),與其他現(xiàn)代堿性去活色譜柱相比，ACE色譜柱總是能給出明顯更好的峰形和柱效（圖6）。  

圖 5：峰拖尾相互作用  

硅膠固定相載體表面上的酸性硅醇基可形成與堿性化合物相互作用的離子交換位點(diǎn)。  

這種離子交換的相互作用通常可以導(dǎo)致峰保留（二次保留），并當(dāng)采用反相HPLC分離胺類(lèi)化合物時(shí)引起峰拖尾。  

一種幾乎消除了硅醇基對(duì)色譜分離不利影響的硅膠基質(zhì)固定相  

圖 6：峰拖尾比較  

條件
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm
流動(dòng)相：40％甲醇，60％水
流速：0.2 mL/min
溫度：22oC
樣品：吡啶  

報(bào)告了堿性化合物（吡啶）在各種常見(jiàn)C18色譜柱上的塔板數(shù)。  

在10％峰高下測(cè)量塔板數(shù)，以使峰拖尾納入在測(cè)量中。  

ACE C18-PFP由于其超惰性性質(zhì)而達(dá)到了Z高塔板數(shù)。  

3.ACE Excel為UHPLC帶來(lái)了享有盛譽(yù)的ACE HPLC性能  

重要的是要認(rèn)識(shí)到色譜柱的選擇性和柱效是獨(dú)立的變量，在開(kāi)發(fā)分離方法時(shí)您不必選擇使用一種而不使用另一種。事實(shí)上，為了實(shí)現(xiàn)Z佳的總體分離效果，您應(yīng)當(dāng)對(duì)上述兩個(gè)變量以及保留值進(jìn)
行優(yōu)化。當(dāng)需要實(shí)現(xiàn)高速分離時(shí)尤其如此。（參見(jiàn)圖7）  

圖 7：利用柱效和鍵合相選擇性來(lái)開(kāi)發(fā)更快的分離方法  

條件：
流動(dòng)相：  

A = 5mM甲酸（0.189）ml / L;
A = 5mM甲酸（溶于甲醇中）
柱溫：40℃
檢測(cè)：PDA, 254nm  

樣品：
1. 阿司匹林
2. 非那西丁
3. 1,3-二硝基苯
4. 苯甲酸乙酯  

5. 尼美舒利
6. 布洛芬
7. 吲哚美辛

利用UHPLC色譜柱更高的柱效，可在更高的流動(dòng)相流速下使用更短的色譜柱，以使這種混合物的分離時(shí)間縮短80%（相比HPLC色譜柱）。
然而，也可以通過(guò)優(yōu)化鍵合相的選擇性來(lái)進(jìn)一步縮短分離時(shí)間，在這個(gè)案例中，就是利用了C18-PFP鍵合相所具有的增強(qiáng)的選擇性。

與C18UHPLC色譜柱、C18 HPLC色譜柱相比，ACE Excel C18-PFP UHPLC色譜柱分別將混合物的分離時(shí)間縮短了80％以上以及96％，同時(shí)保持了所有峰的分離度。

ACE Excel UHPLC色譜柱的設(shè)計(jì)旨在充分利用低擴(kuò)散、超高壓UPLC?和UHPLC儀器（高達(dá)1000 bar），并可與所有市售UPLC和UHPLC系統(tǒng)相兼容。
ACE Excel UHPLC色譜柱可以為堿性化合物提供更佳的峰形，改善柱子與柱子之間的重現(xiàn)性，提供額外的利用多種分離機(jī)制的固定相，以及改善色譜柱的耐用性。

ACE Excel UHPLC色譜柱的可用性意味著色譜分析師在使用UPLC和UHPLC儀器時(shí)有更多的選擇來(lái)獲得更好的結(jié)果。

圖 8：ACE Excel色譜柱提供快速、高分辨率的分離

條件
色譜柱：ACE Excel C18, 2 μm, 3.0 x 50 mm
流動(dòng)相：60秒內(nèi)從30%B至B
A =水+ 0.1％TFA B =乙腈
流速：2.5 mL/min
柱溫：40oC
壓力：703 bar (10,335 psi)
檢測(cè)：PDA, 254 nm
儀器：安捷倫1290 UHPLC
化合物
1. 乙酰苯胺
2. 苯乙酮
3. 苯丙酮
4. 苯丁酮
5. 二苯甲酮
6. 苯戊酮
7. 苯己酮
8. 苯庚酮
9. 苯辛酮

ACE Excel C18色譜柱可在不到60秒內(nèi)提供這9種分析物的基線(xiàn)分離。

4.已經(jīng)證實(shí)ACE HPLC色譜柱和ACE Excel UHPLC色譜柱具有持久耐用的、可靠的日常性能和zhuo越的色譜柱壽命。  

通過(guò)鍵合在硅膠固定相載體上的硅氧烷的酸化水解可以失去鍵合相，從而降低色譜柱的壽命。該酸水解隨著流動(dòng)相pH的降低和柱溫的升高而增加。  

與C18相相比，較短的烷基相如C4和C3以及苯基相通常更容易失去鍵合相。此外，低純度的硅膠固定相載體和低表面覆蓋的固定相載體使得一些鍵合相更易于酸解。
由于使用超高純度的硅膠固定載體粒子以及鍵合相的極高表面覆蓋，ACE鍵合相表現(xiàn)出極高的穩(wěn)定性。（參見(jiàn)圖9）
盡管所有ACE鍵合相的穩(wěn)定性都很優(yōu)異，但是一些鍵合相并不像其它鍵合相那樣穩(wěn)定。例如，通常認(rèn)為C18鍵合比柱長(zhǎng)較短的烷基相、PFP相和苯基鍵合相更穩(wěn)定。  

實(shí)際上，典型的苯基固定相穩(wěn)定性不佳是該相在方法開(kāi)發(fā)中不常被選擇的主要原因之一。
為了解決這個(gè)問(wèn)題而開(kāi)發(fā)了ACE C18-AR，其允許色譜分析利用強(qiáng)大的π-π和偶極-偶極分離機(jī)制，并仍然享有C18相的堅(jiān)固性及耐用性。  

如圖10所示，ACE C18-AR不僅對(duì)典型的苯基鍵合相具有非常優(yōu)異的穩(wěn)定性，它甚至還比許多其他C18鍵合相表現(xiàn)出更佳的穩(wěn)定性。  

類(lèi)似地，ACE C18-PFP提供了多種分離機(jī)制，可以利用它們實(shí)現(xiàn)更佳的總體分離效果，同時(shí)從C18相的穩(wěn)定性中受益。  

圖 9：酸穩(wěn)定性，pH 1.8  

條件
色譜柱：ACE 4.6 x 150 mm
流動(dòng)相：50% CH3CN, 50%水
流速：1.0 mL/min
溫度：22 °C
分析物：菲  

酸性暴露條件：
流動(dòng)相：50% CH3CN 50% 0.1%TFA（溶于水中）（pH 1.8）
流速：1.0 mL/min
溫度：22 ℃  

圖10：加速柱穩(wěn)定性研究：pH 1.9時(shí)80℃  

酸性暴露條件：
流動(dòng)相：5:95 MeOH/0.1% TFA（溶于水中）（pH 1.9）
流速：0.20 mL/min
溫度：80 ℃
色譜柱尺寸：50 x 2.1mm
分析物：菲  

使用設(shè)計(jì)用于加速柱降解下的條件，ACE C18-AR相顯示保留損失極少，其壽命相當(dāng)于高度穩(wěn)定的ACE C18相。兩種固定相均由相同的超純硅膠而制成，而且比Zorbax SB-C18的耐久性更好(Zorbax SB-C18曾視作在高溫和低pH條件下具有極好穩(wěn)定性的固定相）。
正如預(yù)期的那樣，基于低純度硅膠（Waters Spherisorb ODS2）的C18鍵合柱在這些加速條件下壽命大大降低。
特別值得注意的是常規(guī)苯基色譜柱與ACE C18-AR的壽命比較結(jié)果。與ACE C18-AR相比，盡管使用高純度二氧化硅，苯基色譜柱的壽命仍降低，這表明ACE C18-AR可能適用于那些使用苯丙基色譜柱壽命短的應(yīng)用。  

將HPLC和UHPLC連接到通常被稱(chēng)為L(zhǎng)C-MS的質(zhì)譜儀上已經(jīng)相當(dāng)普遍。  

然而，質(zhì)譜對(duì)可能從HPLC/UHPLC色譜柱上洗脫下來(lái)的微量的鍵合相（稱(chēng)為柱“流失”）非常敏感。柱  

流失可能會(huì)干擾分析結(jié)果，并且重要的是，LC-MS應(yīng)用中所選擇的色譜柱具有足夠穩(wěn)定的鍵合相以避免過(guò)量的柱流失。  

圖11表明ACE C18-PFP色譜柱幾乎沒(méi)有“流失”干擾LC-MS分析。  

C18-PFP（以及ACE C18和ACEC18-AR）的穩(wěn)定性使得這些色譜柱更適合LC-MS應(yīng)用。  

圖 11：ACE C18-PFP色譜柱的低柱流失使其成為L(zhǎng)C/MS應(yīng)用中的理想選擇  

條件
色譜柱尺寸：50 x 3.0 mm
流動(dòng)相：梯度：在5分鐘內(nèi)從5至95% B，95% B時(shí)持續(xù)5分鐘
A: 0.1％甲酸(溶于水中)
B: 0.1％甲酸(溶于乙腈中)
流速：0.43 mL/min
溫度：60oC
檢測(cè)：安捷倫1100 MSD ESI正離子快速掃描模式,快速掃描全50 – 1000 m/z
樣品：空白運(yùn)行  

柱流失可能會(huì)干擾LC-MS應(yīng)用中目標(biāo)分析物的檢測(cè)和測(cè)量。  

ACE C18-PFP色譜柱未顯示柱流失。  

所有ACE色譜柱的低流失特性使其非常適合LC-MS應(yīng)用。  

UHPLC色譜柱可能缺乏耐用性。加上入口篩板堵塞的可能性，您可能面臨色譜柱的耐用性不如HPLC色譜柱的問(wèn)題。  

ACE Excel色譜柱非常寬容，并提供您期望從HPLC色譜柱中獲得的相同耐用性和使用壽命。  

ACE Excel將改變您對(duì)UHPLC色譜柱耐用性的看法。  

ACE Excel色譜柱不僅填裝的更好，還采用了ZL的入口篩板設(shè)計(jì)，使其比其它UHPLC色譜柱更不容易被堵塞。  

仍建議您像使用任何UHPLC色譜柱一樣過(guò)濾樣品和流動(dòng)相，但ACE Excel色譜柱比其他UHPLC色譜柱更為寬容，并提供與HPLC色譜柱相同的耐用性和使用壽命。  

圖 12：ACE Excel色譜柱在耐用性方面有良好的口碑  

將2.1×100mm ACE Excel C18 UHPLC色譜柱在平均1,000 bar（14,500 psi）壓力下進(jìn)行2000多個(gè)梯度的運(yùn)行。  

在該穩(wěn)定性研究結(jié)束時(shí)，柱效（塔板數(shù)）和保留時(shí)間基本保持不變。  

5.ACE Excel色譜柱具有口碑zhuo越的可重現(xiàn)性。  

柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性受硅膠固定相載體的生成、固定相與固定相載體的鍵合以及色譜柱中固定相的填充的影響。  

在色譜柱的制備過(guò)程中，每個(gè)階段被控制得越好，色譜柱的可重現(xiàn)性和質(zhì)量則越好。
ACE色譜柱在色譜柱制備過(guò)程中的每個(gè)階段均得到了全面控制。  

這些控制措施確保ACE色譜柱在柱間以及批次之間產(chǎn)生可靠且可預(yù)測(cè)的性能。  

圖13提供了典型批次驗(yàn)證測(cè)試的實(shí)例。  

硅醇活性的細(xì)微變化是柱子與柱子之間選擇性變化的主要原因之一。  

ACE和ACE Excel色譜柱由于使用超純?cè)噭┖蛧?yán)格的制造工藝控制（可以獲得具有均一表面特性的高純度硅膠固定相載體）而具有出色的可重現(xiàn)性。  

將這種高純度硅膠與先進(jìn)的鍵合技術(shù)相結(jié)合，可以產(chǎn)生一系列高惰性的固定相，這些固定相幾乎消除了色譜中的硅醇干擾，從而提供zhuo越的柱子與柱子之間的可重現(xiàn)性。  

6.ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴(kuò)展性。  

相同的質(zhì)量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現(xiàn)性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，或需要分離和純化目標(biāo)化合物時(shí)放大到制備應(yīng)用上。  

柱效當(dāng)然會(huì)改變，但可以預(yù)料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。  

圖14闡明了當(dāng)使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進(jìn)行操作時(shí)，可以預(yù)見(jiàn)到分析物一致的譜帶間距類(lèi)型（選擇性）。  

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴(kuò)展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時(shí)，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動(dòng)相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長(zhǎng)：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對(duì)羥基苯甲酸乙酯

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明分離從UHPLC擴(kuò)展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當(dāng)使用ACE Excel UHPLC色譜柱進(jìn)行快速方法開(kāi)發(fā)，且該方法必須可轉(zhuǎn)移到HPLC時(shí)，易擴(kuò)展性則顯得特別有價(jià)值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無(wú)論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動(dòng)相：1.4分鐘內(nèi)從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時(shí)持續(xù)0.30分鐘，在1.10分鐘內(nèi)從30至90％B，在90％B時(shí)持續(xù)0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測(cè)：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運(yùn)行
儀器：島津Prominence UFLC系統(tǒng)

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明ACE固定相的選擇性一致，無(wú)論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉(zhuǎn)移更加容易。同時(shí)也使得從分析型應(yīng)用擴(kuò)展到制備型應(yīng)用更加容易。

        大家都知道HPLC色譜柱的壽命是有限的，在使用過(guò)程中隨著時(shí)間的推移，其性能開(kāi)始下降。你可以通過(guò)峰形和峰形之間的分離，柱背壓的不規(guī)律增加以及重影峰的出現(xiàn)來(lái)判斷HPLC色譜柱的性能出現(xiàn)了下降。色譜柱是昂貴的色譜耗材，平常使用完畢后需要保養(yǎng)。如果色譜柱真的發(fā)生了性能下降，有什么方法可以恢復(fù)呢?

        首先，如果色譜柱由于過(guò)載或使用不兼容的流動(dòng)相而結(jié)垢，是可以恢復(fù)的，但已經(jīng)損壞的色譜柱或已經(jīng)過(guò)使用壽命的色譜柱無(wú)法恢復(fù)，需要更換。

        色譜柱還原程序如下，供大家參考：

        反相柱

        反相分離是大多數(shù)HPLC分離中使用的主要操作模式。填料主要由C18，C4，CN，NH2和苯基固定相組成。建議以水-乙腈-異丙醇-庚烷-異丙醇-乙腈-流動(dòng)相的順序用10至20倍體積的溶劑洗脫

        正相柱（氨基，二醇，硝基，氨基固定相）

        用20倍體積的溶劑沖洗，按照庚烷-異丙醇-乙腈-

       水-異丙醇-庚烷的順序。

        GPC / GFC色譜柱

        用5倍體 積且PH值為3的0.1%磷酸鹽緩沖液沖洗。如果使用了保留力強(qiáng)的蛋白質(zhì)，則使用從水到乙腈再到水的60分鐘梯度液沖洗。

        色譜柱在使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對(duì)稱(chēng)因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行（出廠測(cè)試所使用的條件是zui佳條件），只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。

        恒譜生色譜柱柱管由不銹鋼制成，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過(guò)拋光，減小管壁效應(yīng)，提高柱效，柱中填充鍵合硅膠或聚合物填料。色譜柱基于高純硅膠，采用獨(dú)特鍵合技術(shù)，具有優(yōu)異的峰形，靈敏性好。基質(zhì)金屬含量低，對(duì)所有類(lèi)型的分析物均表現(xiàn)完好峰形。機(jī)械強(qiáng)度高，穩(wěn)定性好，質(zhì)控嚴(yán)格，確保色譜柱性能和色譜柱的使用壽命。有多種尺寸規(guī)格可供選擇以適應(yīng)色譜工作者及其使用的不同需求。我們有專(zhuān)業(yè)的技術(shù)工程師團(tuán)隊(duì)為您的需求提供解決方案，歡迎前來(lái)咨詢(xún)了解！

概述

寡核苷酸是一類(lèi)只有50個(gè)以下堿基的短鏈核苷酸的總稱(chēng)（包括脫氧核糖核酸DNA或核糖核酸RNA的核苷酸）。

近幾年，隨著寡核苷酸療法在ZL各種疾病適應(yīng)癥方面取得了臨床上顯著的進(jìn)展，已有多種寡核苷酸類(lèi)藥物，如小干擾RNA (siRNA) 和反義寡核苷酸 (ASO) 藥物獲得了FDA上市批準(zhǔn)。另外還有多種microRNA (miRNA) 和適配體 (Aptamer) 正在研發(fā)中。因此，更大量、更高純度的寡核苷酸產(chǎn)品的需求也隨之日益增長(zhǎng)。

東曹生命科學(xué)提供多種具有高分辨率、選擇性的色譜柱和層析填料產(chǎn)品以滿(mǎn)足從分析到純化制備不同規(guī)模的應(yīng)用需求。

寡核苷酸的HPLC分離模式

下表中列舉了寡核苷酸HPLC分析的幾種分離模式及適用的分離條件。也可以通過(guò)連用MS進(jìn)行檢測(cè)。

ZL性寡核苷酸是由固相化學(xué)合成法制成。在合成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)。產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)包含許多目標(biāo)產(chǎn)物的類(lèi)似物（分子量的差別：堿基數(shù)n-1、n、n+1等），磷酸基S化等的不對(duì)稱(chēng)化合物、異構(gòu)體等。因此，雜質(zhì)的分析監(jiān)控對(duì)工藝和質(zhì)量控制就顯得十分重要。一般而言，通過(guò)陰離子交換色譜法即可實(shí)現(xiàn)這一分析需求。

寡核苷酸IEC-HPLC分析

下圖是使用TSKgel DNA-STAT陽(yáng)離子交換色譜柱分離具有不同序列的4種寡核苷酸引物 (單鏈) 。

在IEC分離模式中，如果使用無(wú)孔填料的色譜柱可以提高分辨率。此款色譜柱采用的是親水性無(wú)孔樹(shù)脂填料，粒徑5μm，表面由開(kāi)放型多層陰離子交換基團(tuán)構(gòu)成。這些特性與創(chuàng)新的化學(xué)鍵合方法相結(jié)合，使其載量更高、操作壓力更低，非常適合于寡核苷酸的高分辨率分析。

寡核苷酸的純度檢測(cè)

在離子交換色譜柱中，可以對(duì)離子基團(tuán)與主成分有一處不同的化合物進(jìn)行分離，比如能夠分離n-1、n、n+1的化合物。下圖是TSKgel DNA-NPR陽(yáng)離子交換色譜柱對(duì)13個(gè)堿基的硫代磷酸寡核苷酸粗樣分析的色譜圖。

TSKgel DNA-STAT色譜柱對(duì)粗制的寡核苷酸與純化后的樣品進(jìn)行純度評(píng)估。

寡核苷酸的分析要點(diǎn)

1、根據(jù)核酸樣品的穩(wěn)定性和大小來(lái)選擇合適的洗脫液。如果核酸的穩(wěn)定性很高，可以采用堿性溶液 (NaOH，pH12) 和高溫60℃條件下分離，可提高分辨率。如果是穩(wěn)定性差的，則推薦使用pH7-8的中性洗脫液，溫度40℃條件下分離。

2、在樣品吸附強(qiáng)的情況下，可使用比NaCl或NaBr洗脫能力更強(qiáng)的NaClO₄進(jìn)行梯度分離。

3、如果樣品是超巨大雙鏈DNA (如質(zhì)粒DNA)，使用TSKgel DEAE-NPR (4.6mm I.D.×3.5cm) 的話(huà)不僅可以獲得高分辨率，而且回收率也會(huì)更好。

上篇文章《寡核苷酸類(lèi)藥物的HPLC分析 (一) TSKgel IEC色譜柱應(yīng)用例》中我們提到了隨著寡核苷酸藥物的研發(fā)步伐越來(lái)越快，對(duì)高純度寡核苷酸產(chǎn)品的需求也日趨旺盛。目前，寡核苷酸主要是通過(guò)化學(xué)合成法制成，在合成過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，離子交換液相色譜法是分析這些雜質(zhì)的重要手段之一。此篇文章我們將介紹尺寸排阻色譜法在寡核苷酸藥物質(zhì)量控制中的應(yīng)用。

在寡核苷酸的分析中，尺寸排阻分離模式是基于堿基數(shù)量、磷酸基不同導(dǎo)致的分子量差別進(jìn)行分離，通常用于簡(jiǎn)單的質(zhì)量控制或純度研究。該模式的優(yōu)點(diǎn)是可以使用接近生理?xiàng)l件的洗脫溶液進(jìn)行等度分離。有時(shí)也會(huì)添加水溶性有機(jī)溶劑來(lái)YZ疏水吸附。

分析不同堿基數(shù)目的寡核苷酸

下圖是采用兩根串聯(lián)的SEC色譜柱TSKgel UP-SW2000來(lái)區(qū)分長(zhǎng)度相差一個(gè)堿基的寡核苷酸混合物 (20-mer和N-1 19-mer)。

TSKgel UP-SW2000是東曹生命科學(xué)ZX開(kāi)發(fā)的粒徑2μm、孔徑12.5nm的硅膠基質(zhì)SEC色譜柱，主要用于分離分子量范圍為1-150kDa的小蛋白、肽和寡核苷酸等生物分子。該色譜柱兼容HPLC和UHPLC系統(tǒng)，因此也能夠從傳統(tǒng)的HPLC-SEC方法轉(zhuǎn)換到UHPLC。

下圖是使用TSKgel G2000SWXL色譜柱分離不同堿基數(shù)量的合成寡核苷酸混合物的譜圖。為了YZ核酸酶活性，有時(shí)會(huì)在流動(dòng)相中添加EDTA等約1 mmol/L的螯合劑。

SEC法分離脂質(zhì)體包被的siRNA

下圖是使用TSKgel SuperSW2000色譜柱對(duì)天然型DNA核酸藥物Defitelio進(jìn)行質(zhì)量分析的示例。

參考文獻(xiàn)：Handbook of analysis of oligonucleotides and related Products, Feb.23 (2011) 125, Edited by J.V. Bonilla et al.

寡核苷酸分析用SEC色譜柱

下表中列出了適用于核酸分離的SEC色譜柱。對(duì)于＜375 bp的短鏈核酸或寡核苷酸，UP-SW3000、UP-SW2000、G3000SWXL以及G2000SWXL這幾款色譜柱都是比較推薦的。

ACE色譜柱可以提供從UHPLC到HPLC再到制備型HPLC的易擴(kuò)展性。

相同的質(zhì)量控制，可以確保不同批次色譜柱的高重現(xiàn)性，也可以保證您更容易地在UHPLC和HPLC方法之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，或需要分離和純化目標(biāo)化合物時(shí)放大到制備應(yīng)用上。

柱效當(dāng)然會(huì)改變，但可以預(yù)料的是，譜帶間距（選擇性）將相同。

圖14闡明了當(dāng)使用相同的ACE鍵合相但不同粒徑填充的色譜柱進(jìn)行操作時(shí)，可以預(yù)見(jiàn)到分析物一致的譜帶間距類(lèi)型（選擇性）。

圖 14：將ACE固定相從UHPLC（2μm）擴(kuò)展到HPLC（3μm和5μm）再至制備型HPLC（10μm）時(shí)，選擇性得到了保留與保證。

條件
流動(dòng)相：35:65 MeCN/0.1%TFA（溶于水中）
溫度：22 ℃
波長(zhǎng)：254 nm

分析物
1. 尿嘧啶
2. 4-羥基苯甲酸
3. 乙酰水楊酸
4. 苯甲酸
5. 2-羥基苯甲酸
6. 對(duì)羥基苯甲酸乙酯

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在填充有相同的鍵合相但不同粒徑的色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明分離從UHPLC擴(kuò)展到HPLC再到制備型HPLC的容易程度。

當(dāng)使用ACE Excel UHPLC色譜柱進(jìn)行快速方法開(kāi)發(fā)，且該方法必須可轉(zhuǎn)移到HPLC時(shí)，易擴(kuò)展性則顯得特別有價(jià)值。

圖 15：ACE固定相可以提供相同的選擇性，無(wú)論它們是UHPLC、HPLC還是制備型HPLC色譜柱

條件
色譜柱：2.1 x 50 mm
流動(dòng)相：1.4分鐘內(nèi)從30% B至90% B
A = 20mM甲酸銨+ 0.1％甲酸
B =乙腈+ 0.1％甲酸
梯度：在30％B時(shí)持續(xù)0.30分鐘，在1.10分鐘內(nèi)從30至90％B，在90％B時(shí)持續(xù)0.40分鐘
流速：0.5 mL/min
柱溫：30oC
檢測(cè)：AB Sciex Triple Quad（TM）5500 MS，以ESI（+）模式運(yùn)行
儀器：島津Prominence UFLC系統(tǒng)

分析物
1. 甲苯咪唑
2. 普羅替林
3. 阿米替林
4. 洛哌丁胺

試驗(yàn)樣品的這些色譜圖在ACE Excel C18 2μmUHPLC色譜柱、ACE C18 3μmHPLC色譜柱和ACE C185μm色譜柱上以相同的流動(dòng)相條件運(yùn)行，結(jié)果闡明ACE固定相的選擇性一致，無(wú)論填充粒徑如何。

這使得從UHPLC到HPLC或HPLC再到UHPLC的方法轉(zhuǎn)移更加容易。同時(shí)也使得從分析型應(yīng)用擴(kuò)展到制備型應(yīng)用更加容易。

尿激酶是從新鮮人尿中提取的，或從人腎組織培養(yǎng)中獲得的一種酶蛋白，是臨床上一種常用的溶解血栓的藥物。它由高分子量尿激酶 (Mw=54000) 和低分子量尿激酶 (Mw=33000) 組成的混合物。

為使尿激酶達(dá)到ZJ分離效果，本應(yīng)用使用粒徑2 μm的TSKgel UP-SW2000超GX液相尺寸排阻色譜柱與G2000SWXL色譜柱，對(duì)尿激酶進(jìn)行了對(duì)比分析。

溶液的配制

色譜流動(dòng)相配制：0.2 mol/L磷酸二氫鈉水溶液，用磷酸調(diào)pH至3.0 。

樣品：尿激酶測(cè)試方法優(yōu)化溶液濃度：2.5 mg/mL

分析條件

儀器：Thermo Ultimate3000

色譜柱1：TSKgel UP-SW2000 (2μm, 4.6 mmI.D.×30cm)

色譜柱2：TSKgel G2000SWXL (5μm, 7.8 mmI.D.×30cm)

流速：0.18 mL/min for UP-SW2000、0.5 mL/min for G2000SWXL

柱溫：25℃

樣品盤(pán)溫度：10℃

進(jìn)樣量：10 μL

檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器@280nm

分析結(jié)果

圖1.  UP-SW2000色譜柱分離譜圖

圖2.  G2000SWXL色譜柱分離譜圖

結(jié)果與討論：

相較于G2000SWXL色譜柱，TSKgel UP-SW2000對(duì)多聚體、高分子量尿激酶、低分子量尿激酶的分離度均有所提高。

同時(shí)對(duì)比了等量溶質(zhì)不同進(jìn)樣體積，高濃度樣品小進(jìn)樣量，分離度較好一些。UP-SW2000色譜柱可滿(mǎn)足藥典要求：高分子量尿激酶峰面積占90%以上，且與低分子量尿激酶分離度大于1.0。