菲羅門色譜柱選擇卡

菲羅門與ACE色譜柱的保養方法

色譜柱是一種消耗品，因此使用壽命有限。

對于大多數應用，色譜柱應持續進行500-2000次注射（進樣），但這會因樣品的清潔度、流動相的pH值和保護柱卡套的使用（是否使用保護柱）而不同。

這里列出的做法有助于Z大限度地提高硅基（硅膠基質）色譜柱的使用壽命。

一、色譜柱的平衡：當從一個流動相更換為另一個流動相時，或者在回收梯度（梯度循環）時，應需要10-20個柱體積。

下表顯示了各種色譜柱尺寸（規格）的色譜柱體積。

如果溶劑的變化不太劇烈（例如80％至20％的ACN/水與ACN至THF（與之相對的由ACN至THF）），則需要的體積較少。

檢查平衡Z簡單方法是進行兩次樣品注射。

如果保留相同，則色譜柱充分平衡；如果保留變化，應增加平衡體積并重新試驗。平衡與溶劑的體積有關，與時間無關。

所以較高的流量（流速）可以減少平衡時間。

                                        近似的色譜柱容量（mL）

二、色譜柱沖洗是一個簡單的過程，可以通過清洗色譜柱中的頑固（保留較強的）物質來延長色譜柱的壽命。

每天結束色譜柱的使用時，應除去一切緩沖液（應除去色譜柱中的緩沖鹽），然后用100％強溶劑（通常為ACN或MeOH，采用反相方法）沖洗色譜柱。

下一頁列出的詳細沖洗程序可以有效恢復色譜柱的性能，但應牢記：色譜柱是一種消耗品，因此請勿期望它能夠永遠的持續使用！

避免用100％的水沖洗反相色譜柱（嵌入極性基團或“AQ”色譜柱除外），因為相（固定相）去濕會影響清洗效果，而且流動相色譜柱的重新平衡會非常緩慢。

對于您的色譜柱，請按照以下所述的一般步驟，使用特定溶劑進行色譜柱沖洗。

應在沖洗之前查看制造商的建議（生產商說明書），以免損壞色譜柱。
1. 拆掉并翻轉色譜柱（拆下色譜并反接）
2. 將色譜柱連接到泵上，而非檢測器（不接檢測器）
3. 用10-20個柱體積的溶劑進行沖洗，且流速不得高于QC色譜圖的流速
4. 如果改變以下步驟，應確保在每個連續步驟中使用可混溶溶劑（溶劑可互溶）

反相色譜柱（C18，C8，C4，苯基，CN，'AQ'型）
a. 流動相無緩沖液
b. MeOH或ACN

如果金屬離子被認為是污染的致因，應使用0.05M EDTA水溶液沖洗，然后用水沖洗，并按上述順序沖洗。使用離子對試劑的色譜柱應專門用于離子對的應用之中。

未鍵合的硅膠柱（SIL）
a. IPA
b. MeOH
c. 乙酸乙酯

鍵合正相柱（CN、NH 2、二醇）
a. 三氯jia烷
b. IPA
c. 二氯jia烷
d. 己烷

陰離子交換柱（SAX，WAX）
a. 水
b. 甲醇
c. 三氯jia烷
d. 甲醇
e. 水

陽離子交換柱（SCX，WCX）
a. 水（沖洗時注入4x200L的DMSO）
b. THF

蛋白質的體積排阻柱
對于弱保留的蛋白質
a. 0.1M磷酸鹽緩沖液，pH為3
對于強保留的蛋白質
a. 100％水至100％ACN的梯度，運行60分鐘

三、色譜柱的合理存放有助于延長柱的使用壽命。

Z簡單的存放步驟為：從柱中除去一切緩沖液，然后用10-20個柱體積的強流動相溶劑（例如用于反相的MeOH或ACN）清洗柱，以除去柱中的頑固（強保留）物質。

然后用制造商指定的存儲流動相，以10-20個柱體積的容量沖洗色譜柱（該信息應隨色譜柱提供，并在QC檢測色譜圖中進行詳細的說明）。

Z后，安全地蓋上柱帽（擰緊堵頭），以防流動相蒸發。
除了色譜柱制造商明確建議的特定情況（例如一些離子交換柱）外，請勿使用緩沖液或者少于約25％的有機溶劑來用于儲色譜柱存儲，因為它們會導致微生物的滋生。（保存色譜柱，以防微生物的滋生）

氨基酸作為構成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。
隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動相對其保留很弱，同時部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動相和檢測器的選擇更有挑戰。

本文系統總結廣州菲羅門積累經典色譜應用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析四種廣受關注的應用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個難點：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團，可以實現在C18柱+反相流動相的體系下進行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當選擇氨基酸非衍生直接分析時，對于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實現保留，當使用磷酸鹽類時，可以在截止波長條件下用UV檢測，比較經典的應用是用ACE HILIC-B檢測門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS為檢測器的條件下分析氨基酸。

三、保護型氨基酸手性分析

當氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護起來時，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實現非常好的分離，有現成的分析方法，可以極大地減少方法開發的時間。

四、非保護氨基酸直接手性分析

對于非保護的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經實現了有機酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實現了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結: 本文全面總結了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析。

對于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術工程師。

氨基酸作為構成多肽和蛋白的基本單元，是非常重要的一類化合物。

隨著生物藥的逐漸興起，作為原料的氨基酸的質量分析的需求也越來越大。
大部分氨基酸由于至少同時含有大極性的氨基和羧基，因此整體極性很大，常用的C18柱+反相流動相對其保留很弱，同時部分氨基酸由于紫外吸收很弱，因此讓流動相和檢測器的選擇更有挑戰。

本文系統總結廣州菲羅門積累經典色譜應用，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析四種廣受關注的應用。

一、氨基酸衍生化分析
氨基酸衍生的方法比較多，最常用的是AQC衍生和PITC衍生。
雖然過程相對繁瑣，但是通過衍生后，一舉解決了氨基酸分析的兩個難點：
保留和紫外吸收。
通過衍生反應在氨基酸上接上疏水且有紫外吸收的基團，可以實現在C18柱+反相流動相的體系下進行HPLC分析。

AQC衍生法：

 PITC衍生法：

二、非衍生氨基酸直接分析

當選擇氨基酸非衍生直接分析時，對于有些疏水性比較好的氨基酸，可以直接用C18類柱子分析，比如：

可以選用帶有HILIC作用的色譜柱實現保留，當使用磷酸鹽類時，可以在截止波長條件下用UV檢測，比較經典的應用是用ACE HILIC-B檢測門鳥氨酸：

菲羅門也推出Comix系列智能神柱，可以在以ELSD、 CAD或者MS為檢測器的條件下分析氨基酸。

三、保護型氨基酸手性分析

當氨基酸上的氨基和羧基用Boc和/或FMOC等保護起來時，可以用正相或者反相的多糖類手性柱實現非常好的分離，有現成的分析方法，可以極大地減少方法開發的時間。

四、非保護氨基酸直接手性分析

對于非保護的氨基酸，菲羅門推出AAOA分析柱，即通過鍵合D-青霉胺于十八烷基柱上而成的配體交換型手性柱。該手性柱手性柱可以用于拆分α-型有機酸、α-型非衍生氨基酸及其衍生物、二元胺、二肽、內酰胺和氨基醇等。

到目前為止，我們已經實現了有機酸如D, L-乳酸、D, L-酒石酸的拆分，也實現了氨基酸如D, L-丙氨酸，D, L-天門冬氨酸，D, L-纈氨酸，D, L-脯氨酸：

總結: 本文全面總結了氨基酸類的HPLC分析方法，包括氨基酸衍生化分析、非衍生氨基酸直接分析、保護型氨基酸的手性分析以及非保護型氨基酸直接手性分析。

對于具體氨基酸的分析如有疑問，可以電話020-22826668找到您專屬的技術工程師。

由廣東省藥學會策劃執行的2019第二屆藥物雜質分析分離學術研討會在廣州圓滿召開。

本次會議得到了廣州菲羅門、暨南大學、華南師范大學、島津、研創、等有關單位的大力支持，為期兩天的論壇共吸引行業人員300余人參加。

其次，還對藥物中《基因毒雜質的分析》等有關話題分享了經驗心得，就制藥行業實驗的發展與形勢展開探討，同時提出了色譜分析環節中的重要性以及實踐戰略與技術方案。

核苷酸專用柱是什么柱？菲羅門為您解答

核酸堿基、核苷和核苷酸的HPLC分析

核苷是由含氮堿基與核糖或脫氧核糖縮合而成，核苷與磷酸合成核苷酸。核苷酸主要參與構成核酸，在人體內廣泛分布，具有多種生物學功能，如與能量代謝有關的三磷酸腺苷（ATP）、脫氫輔酶等。

為滿足不同物質的分離要求，菲羅門推薦多款色譜柱對其進行HPLC分析。

一、 核苷異構體的分離

1.β-胸苷（dT）與α-胸苷的分離

ACE C18-AR是一種獨特的C18鍵合的HPLC色譜柱，結合了C18烷基鏈的疏水作用和苯基的芳香選擇性，而且可以耐水相，非常適合芳香化合物的分離。

色譜條件：

色譜柱ACE Excel C18-AR 5μ 150 × 4.6 mm

貨號：EXL-129-1546U

2.尿苷和阿糖尿苷的分離

ACE C18-Amide是一款嵌入極性酰胺基團的C18柱，相當于同時具備C18與酰胺基的選擇性，同樣耐水相，很適合分析含氫鍵給體的物質。

色譜柱：ACE Excel C18-Amide 3μ 100 X 4.6 mm

貨號：EXL-1112-1046U

二、 核酸堿基和核苷的分析

ACE HILIC-N是ACE三款親水作用色譜柱中的中性柱，相對于陰陽離子都顯示出較低的離子交換能力，通過極性相互作用、吸附和一定程度的分散（分配能力）來保留分離核酸堿基、核糖核苷和脫氧核糖核苷。

色譜柱：ACE HILIC-N 5μ 150 X 4.6 mm

貨號：HILN-5-1546U

三、 核酸堿基、核苷和核苷酸的分析

Titank C18有機硅膠雜化色譜柱，是在硅膠的硅氧網狀構造中以更加穩定的烷基來取代在堿性條件下不穩定的硅氧橋連接，具有寬pH耐受范圍（1-12）、低背壓和水相穩定的特點，對于較大極性的物質有很好的保留。

色譜柱：菲羅門 Titank C18 3μ 50 × 3.0mm

貨號：FMB-5559-YONU

四、 單磷酸核苷酸的分離

ACE NH2是氨丙基鍵合的硅膠柱，與ACE其它固定相的色譜柱一樣，都是采用超惰性的硅膠制成，具有很好的穩定性和使用壽命。

色譜柱：ACE Excel 3μ NH2

貨號：EXL-1114-1546U

五、 九種核苷酸的分離

Comixshell AIRP是陽離子嵌入烷基鍵合的核殼硅膠柱，同時具有反相和陰離子交換選擇性，是Comix系列色譜柱中的一種。

Comix系列色譜柱可以用來同時檢測無機和有機化合物、分離大極性物質及復雜體系。

色譜柱：菲羅門 Comixshell AIRP 2.7μ 150 × 4.6 mm

貨號：FMF-AIRP-EONU

總之，不同的疏水性或是極性作用力的固定相可以提供不同的選擇性，所以選擇正確的固定相是至關重要的一步。

色譜柱是氣相色譜儀的心臟，如何選擇色譜柱？