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FuniCut? EcoRV限制性內切酶(EcoRV酶切序列位點GAT/ATC)

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詳細介紹

酶切點位

5'-GATATC-3'

3'-CTATAG-5'

 

產品描述

FuniCut™系列內切酶是通過基因工程重組技術,可在5~15 min內精確完成DNA切割的快速限制性內切酶,適用于快速切割質粒DNA、PCR產物、基因組DNA等。FuniCut™系列快速內切酶共用一種酶切緩沖液,從而簡化了酶切反應體系,另外,有良好的酶活冗余度,可輕松處理底物過量或困難模板的酶切。

 

產品組分

組分編號

組分名稱

產品規格

15011-A

FuniCut™ EcoRV

200 μL

15011-B

10×FuniCut™ Buffer

2×1 mL

15011-C

10×FuniCut™ Color Buffer

2×1 mL

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20°C保存,有效期2年。

 

識別位置

5'-GAT↓ATC-3'

3'-CTATAG-5'

 

推薦反應條件

1× FuniCut™ 緩沖液;

最適37°C孵育。

 

失活條件

80°C孵育20 min。

 

注意事項

1)3 h孵育未表現星號活性,延時酶切可能出現星號活性;

2)受EcoBI甲基化影響,序列可能重疊,剪切可能受影響;

3)為了您的安全和健康,請穿實驗服并佩戴一次性手套操作

4)本產品僅作科研用途!

 

質量控制

1. 功能活性檢測:最適反應溫度下,在20 μL反應體系中,1 μL酶能夠在15 min內完全消化1 μg λDNA。

2. 超長時間孵育檢測:最適反應溫度下,將1 μL酶與1 μg λDNA共孵育3 h,未檢測到其他核酸酶污染或星號活性引起的底物非特異性降解,但延長孵育時間可能出現星號活性。

3. 酶切-連接-再酶切檢測:最適反應溫度下,使用1 μL酶消化底物,回收酶切產物,在22°C下使用適量T4 DNA連接酶可以將酶切產物重新連接,將連接產物再次回收后,使用相同的內切酶可以重新切開連接產物。

4. 非特異性內切酶活性檢測:最適反應溫度下,將1 μL酶與1 μg超螺旋質粒DNA共同孵育4 h后,使用瓊脂糖凝膠電泳檢測,質粒DNA仍然處于超螺旋狀態。

5. 藍白斑檢測:將含有單一lacZα基因的載體以1 μL酶消化,重新連接后轉化入大腸桿菌感受態細胞,涂布在含有對應抗生素、IPTG和X-gal的LB培養基平板上。連接正確的產物會生長出藍色菌落,而連接錯誤(即DNA末端切口不完整)的產物將得到白色菌落。對于FuniCut™系列限制酶而言,白色菌落比例應小于1%。

 

使用方法

1. DNA快速酶切流程

1)按如下建議的加樣順序配制體系反應液(冰上操作):

組分

質粒DNA

PCR產物

基因組DNA

ddH2O

15 μL

16 μL

30 μL

10×FuniCut™ Buffer或10×FuniCut™ Color Buffer

2 μL

3 μL*

5 μL

底物DNA

2 μL(~1 μg)

10 μL (~0.2 μg)

10 μL (5 μg)

FuniCut™ EcoRV

1 μL

1 μL

5 μL

Total

20 μL

30 μL

50 μL

*本體系指已純化后的PCR產物。未純化的PCR產物具備一定的離子強度,10×FuniCut TM Buffer加入量可適當減少至2 μL。若下一步進行克隆等實驗,酶切前需純化PCR產物。

2)輕柔吸打或輕彈管壁以混勻(切勿渦旋),然后瞬時離心以收集掛壁液滴。

3)37°C孵育15 min(質粒),或15~30 min(PCR 產物),或30~60 min(基因組 DNA)。

4)80°C孵育20 min即可使酶失活,停止反應(可選)。

2. 雙酶切或多酶切

1)每種內切酶的用量為1 μL,并根據需要適當擴大反應體系。

2)所有內切酶的體積總和不得超過總反應體系的1/10。

3)如果選用的幾種內切酶的最適反應溫度不同,應先以最適溫度低的酶開始酶切,再添加最適溫度較高的酶,以較高的溫度進行孵育。

3.質粒的擴大反應體系

組分

體積(20 μL

體積(20 μL

體積(50 μL

DNA

1 μg

2 μg

5 μg

FuniCut™ EcoRV

1 μL

2 μL

5 μL

10×FuniCut™ Buffer或10×FuniCut™ Color Buffer

2 μL

2 μL

5 μL

Total

20 μL

20 μL

50 μL

:如果總反應體系大于20 μL,可使用水浴、金屬浴或沙浴,并增加孵育時間。

 

不同DNA中的識別位點數

λDNA

ΦX174

pBR322

pUC57

pUC18/19

SV40

M13mp18/19

Adeno2

21

0

1

1

0

1

0

9

 

甲基化修飾影響

Dam

Dcm

CpG

EcoKI

EcoBI

無影響

無影響

無影響

無影響

序列可能重疊

剪切可能受影響

 

不同反應緩沖液中的活性

反應緩沖液

FuniCut™

Buffer

Thermo Scientific

FastDigest Buffer

NEB

CutSmart® Buffer

Takara

QuickCut™ Buffer

活性

100%

100%

100%

100%

:活性數據來自翌圣生物限制酶標準反應體系下的檢測。

 

同裂酶

Eco32I

:同裂酶對于不同的甲基化修飾可能具有不同敏感性。

keywords: EcoR5、EcoR 5、EcoR V、EcoRV、EcoR Ⅴ、EcoRⅤ

 

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貨號

規格

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HB211123

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