Hieff NGS^® Dual Barcode Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI^®是針對 MGI^®高通量測序平臺專門開發設計的單鏈環化試劑盒。本產品采用高質量的酶和經優化后的 Buffer 組成，顯著提高反應效率， 使整個環化消化流程在 30 min 內完成。本試劑盒適用于所有連接華大標準的雙標簽 PCR 接頭文庫擴增產物， 除建庫試劑本身的限制外，本環化試劑盒不限 MGI^®測序平臺。

 

產品組分

組分編號與名稱		13340ES08	13340ES16	13340ES96
13340-A	DB Splint Oligo	48μL	96 μL	576 μL
13340-B	Splint Buffer	120μL	240 μL	2×720 μL
13340-C	Ligase	40μL	80 μL	480 μL
13340-D	Digestion Buffer	64μL	128 μL	768 μL
13340-E	Digestion Enzyme	16μL	32 μL	192 μL

 

運輸與保存方法

冰袋運輸。

所有組分-20°C保存，有效期1年。

 

注意事項

一、關于操作

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。

6. 定時對各實驗區域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環境的潔凈度。

7. 本產品僅作科研用途！

 

二、樣本要求及處理

2.1樣本量要求

1. 本試劑盒推薦的Input DNA量為1 pmol；若PCR產物不足，最低可降至0.5 pmol投入量。

2. 若有特殊的環化投入量需求，則按照文庫制備試劑盒的要求投入所需的 Input DNA 量。

3. 不同片段大小DNA 1 pmol 分子對應不同的質量，可根據公式 1 計算或參考表1選擇所需的 Input DNA量：

公式 1 PCR 產物摩爾數與質量間的換算

1 pmol PCR 產物對應的質量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表1  不同片段大小PCR產物1pmol對應產量

插入片段大?。?/font>bp）	PCR產物主片段大?。╞p）	1 pmol對應產量（ng）
150	300	198
200	350	231
250	400	264
300	450	297

2.2 樣本混樣要求

1. Input DNA可以是單個樣本，也可以是多個帶有不同Barcodes的樣本的混合物。

2. 對樣本進行混合時需滿足Barcodes混合的要求，可參考表華大雙標簽 PCR 接頭試劑盒說明書選擇合適的Barcodes進行混合。

3. 混合的樣本總量推薦為1 pmol，若每個樣本所需數據量相同，則等量混合，每個樣本所需的質量按照公式2進行計算：

公式 2 混合樣本中單個樣本所需質量的計算

單個樣本所需的質量(ng)=1 pmol Input DNA對應的質量（ng）/混合的樣本個數 N

4. 單個樣本或混合后樣本用于環化時，體積應為34 μL，若不足則用 ddH₂O補充至34 μL。

三、關于磁珠純化（Bead-based Clean Up）

1. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致純化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現用現配，否則將影響回收效率。

4. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥約5 min。

5. 單鏈環產物純化保存，可使用TE Buffer洗脫，產物可于-20°C可保存1個月。

四、關于文庫質檢（Library Quality Analysis）

1. 單鏈環產物純化后推薦使用 Qubit^® ssDNA Assay Kit 單鏈DNA熒光染料試劑對純化后產物進行定量。  
2. 針對華大智造高通量測序平臺， 單鏈環產物純化后產量應≥80 fmol（足夠2次上機測序）。
3. 可根據公式3計算或參考表2。

公式 3 單鏈環摩爾數與質量間的換算
80 fmol單鏈環對應的質量(ng)=0.08×DNA 主片段大小(bp)×0.33

表2  不同PCR產物片段大小對應80fmol單鏈環產量

插入片段大小（bp）	PCR產物主片段大小（bp）	80 fmol對應產量（ng）
150	300	7.92
200	350	9.24
250	400	10.56
300	450	11.88

 

使用方法

一、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產品。

2. 文庫質控：Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit^® ssDNA Assay Kit。

3. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer（10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。

二、操作流程

圖1  單鏈環化文庫構建流程

三、操作步驟

3.1 變性

1. 根據文庫長度，取1 pmol 至0.2 ml PCR管中，用ddH₂O補充至34 μL。

2. 將表3中試劑解凍后，顛倒混勻并置于冰上備用。

3. 于冰上配制表3反應體系。

表3  DNA變性體系

名稱	體積（μL）
單個或混合好的雙鏈文庫	34
DB Splint Oligo	6
Total	40

4. 混勻后，在PCR儀上進行98℃變性3 min，之后立即置于冰上，冰浴2 min 后瞬時離心。

3.2 單鏈環化

1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表4反應體系。

表4  單鏈環化體系

名稱	體積（μL）
上一步反應物	40
Splint Buffer	15
Ligase	5
Total	60

3.使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4.將PCR管置于PCR儀上，按照表5所示攝制反應程序，進行單鏈環化反應。

表5單鏈環化反應程序

溫度	時間
熱蓋105°C	OFF
37°C	15min
4°C	Hold

3.3 酶切消化

1. 將表6中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。

2. 于冰上配制表6所示反應體系。

表6  酶切消化體系

名稱	體積（μL）
上一步反應物	60
Digestion Buffer	8
Digestion Enzyme	2
Total	70

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。

4. 將PCR管置于PCR儀上，按照表7的條件進行反應：

表7  酶切消化反應程序

溫度	時間
熱蓋105°C	OFF
37°C	10 min
4°C	Hold

5. 反應結束后，瞬時離心，立即進行純化。

3.4 消化產物純化

該步驟使用磁珠對3.3步驟的產物進行純化。

1. 準備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取120 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads至消化產物中，渦旋或吹打混勻，室溫孵育10min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約2 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂。

8. 將PCR管從磁力架中取出，加入22 μL TE Buffer，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置10 min。

9. 短暫離心，將 PCR 管始終置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約 2min），將上清小心移至新 PCR 管中。

★停止點：環化純化產物，可置于-20℃儲存一個月。

3.5 消化產物質控

使用Qubit^® ssDNA Assay Kit熒光試劑對酶切消化產物進行定量，具體請參見注意事項四。

 

HB210803