前沿進展：通過微生理方法解決藥物分子預測難題

—第四屆大西洋毒理學研討會報告（二）-1

Biology-inspired Microphysiological System Approaches to Solve the Prediction Dilemma of Substance Testing

t4 Workshop Report-跨大西洋毒理學智庫的報告，該智庫由Doerenkamp Zbinden基金會贊助，由巴爾的摩、康斯坦茨和烏得勒支的毒理學負責人合作完成。本文所表達的觀點是作者本人的觀點，不一定代表他們的工作機構的觀點。

May 15, 2016

翻譯和整理：北京佰司特貿易有限責任公司

ZJIN出現的微生理系統——在體外模仿人體組織、器官和循環生物學的微流控仿生裝置——被認為是可能徹底改變如今的藥物開發模式。一項近期由美國政府倡議并在歐洲和亞洲開展的研究項目，ZJIN獲得了第Yi個前沿成果：基于微生理系統的人的單器官和多器官工程，在此基礎上建立的測試系統有望模擬不同的疾病階段，并在臨床試驗之前預測毒性、免疫原性、ADME譜和ZHI療效果。這一技術將對藥物發展的未來產生重大影響。此外，基于微生理系統的分析可能會徹底改變我們當前的模式，對任何新物質（例如用于農業、食品、生態系統或化妝品）的危害進行排序，從而取代目前使用的實驗動物模型。來自學術界、工業界和監管機構的36位專家在德國柏林舉辦了一個集中研討會（2015年6月），回顧了目前微生理系統的現狀，并評估了藥物開發周期中廣泛的、具有潛力的方法，提出了可行的技術解決方案，以實現人的體外生物學的下一個級別的技術。此外，會議ZHONG點介紹了器官芯片的重要的案例，以及各種國家和國際項目。ZHOU，概述了未來的路線圖，允許在全 SHIJIE范圍內進行更具預測性和監管認可的物質檢測的方法。

2. Microphysiological systems – an expanding toolbox for hazard, safety, disease and efficacy prediction of particulate matter, chemicals and drug candidates

微生理系統-用于微粒物、化學品和候選藥物的危害、安全、疾病和效能預測的工具箱

2.3 MPS技術的現狀

2.3.1 介紹

任何以靜態細胞培養為基礎的檢測技術的缺點包括氧氣和營養物質限制在給定的3D組織大小，或單層代謝，以及缺乏動態蛋白質梯度。例如，在靜態培養瓶中培養原代人肝細胞時，氧限制早在1968年就被描述過（McLimans等人，1968）。微制造和微流體技術，早在1990年就作為一門科學學科而誕生（Manz等人，1990年），并在20世紀末交付了商業化的單片實驗室平臺（見El-Ali等人，2006年和Whitesides，2006年的評論），與材料科學相關的生物工程的進展使第一種基于板和芯片的微流控組織培養系統的出現，旨在解決上述靜態培養的兩個限制，并復制時空，機械和生物化學線索，這些組織內在的生理行為。MPS開發人員從兩個不同的角度進行開發，其中一些著眼于將營養供應的微流控原理集成到成熟的工業高通量順應靜態細胞培養微滴度井格式中，一些試圖將成熟的工業組織培養生物反應器系統小型化。基于板的MPS開發適應常規靜態細胞培養微滴度板陣列96,384和1536孔，已成為任何生物實驗室的選擇標準。微滴度板提供了額外的優勢，因為它們已經被各行業完全接受為標準[SLAS,2014]。這些平臺出現的理由是，實驗的純粹性質和生物學固有的可變性需要大量的對照實驗、重復和稀釋。此外，分子和細胞生物科學的趨勢已經發展到更高的通量方法，在一次實驗中測試更多的條件。正是由于這些原因，按照本標準設計了手動和自動液體處理和讀數設備。此外，平板中孔的數量較多，如384孔、1536孔甚至是3456孔，提供了減少細胞和試劑體積的額外優勢，導致每次檢測成本的降低。用于組織和器官建模的基于芯片的微生理系統通常是在傳統工業細胞培養生物反應器的基礎上進行了改進，試圖縮小流體和組織培養室的規模，并縮小所需的傳感器和驅動器。20世紀70年代早期發明的自動化動態生物反應器，如中空纖維生物反應器，通過引入人工毛細血管進行介質灌注，大規模解決了氧氣和營養供應的問題（可達1L組織培養）（Knazek，1972）。這些動態灌注組織培養系統后來發展成為具有長期功能的體外器官等效物，在20世紀90年代末作為體外生物人工肝裝置引入醫療實踐（CatapanoandGerlach,2007；Gerlach,1996；Wang等人，2010）。基于這一歷史知識，許多動態的組織特異性生物反應器設備，如用于免疫原性測試的人類人工淋巴結，被縮小，用于體外測試，以降低每個組織培養規模的mL（Giese等人，2006）。圖5展示了一個微型的依賴培養箱的動態生物反應器原型，用于同時培養0.5ml的人體免疫組織。不幸的是，在本世紀的第一個十年中，很明顯，較低的mL規模仍然需要太多的細胞供應，而且仍然太大，無法以合理的成本同時進行高含量測試。這引發了基于芯片的MPS的出現，它采用了芯片上的實驗室平臺來減少組織培養體積，從微到納米級的每個組織培養室。他們的目標是應用自動化泵送系統和電氣、光學和機械轉導來監測和控制在自動化培養箱獨立系統中相關產量的復雜微小組織培養。

圖5：中空纖維灌注的單器官微型盒式生物反應器裝置。 集成機電控制的蠕動泵(A)，10個微控制器(B)。在恒溫箱中運行的微生物反應器用于溫度、濕度和CO2控制(C)。(由ProBioGen AG，德國提供) 

總之，基于平板和芯片的MPS目前旨在反映生理相關參數，包括適當的細胞-細胞、細胞-基質、生化和機械信號。這些能力提供了前所未有的機會來創造微生理系統，這些微生理系統具有捕捉人體疾病外觀、修復和再生過程以及藥物作用的動態的潛力。微生理系統發展的ZXIN進展使細胞環境和/或肺、心臟、血管、肌肉、骨骼、肝臟、生殖系統、神經系統（包括眼睛）、腸道、皮膚、腸道和腎臟的功能單元的工程成為可能。在本章中，我們報告了受生物學啟發的單器官和多器官微生理系統的發展現狀及其在物質檢測中的應用。此外，我們還介紹了利用MPS建模疾病的研究成果。第4章概述了將多器官系統推進到人體芯片解決方案的ZXIN舉措。

2.3.2單器官微生理系統的研究現狀

CellAsic（Leeetal.，2007a）開發了早期微滴度板微流體細胞培養格式，采用被動重力微流體流方法進行體外組織再生，并應用于人類疾病建模和藥物開發。受LukeLee小組工作的啟發（Leeetal.，2007b；Hungetal.，2005b），他們開發了一種微滴度板，有8個獨立的流動單元，不需要管道進行灌注流，而是依賴于被動水平。該設備由粘接在玻璃底部的聚二甲基硅氧烷（PDMS）模壓微流控層和丙烯酸用戶界面組成。在真空歧管的幫助下，細胞被引入，并通過由密集填充的微柱組成的過濾器定位。灌注流是由重力水平結合精心調節的微流體通道的流體阻力誘導的。

PMedizintechnikgmbh（oberschleis.comheim,Germany）智能微標儀是一種基于24孔的先進微生理系統，包括自動顯微鏡、移液機器人和pH、溶解氧和阻抗的微傳感器，并預先安裝在培養箱中（Demmeletal.，2015）。它被成功地用于監測各種細胞類型和原代組織的活力（Kleinhansetal.，2012）和開發新的毒理學終點（Wolfetal.，2011）。相對較高的并行度和移液機器人和顯微鏡的自動化程度使得MPS領域的自主、無標簽的長期實驗成為可能。然而，所使用的PDMS材料具有將候選藥物與該裝置高度非特異性結合的潛力。美國威斯康星大學麥迪遜分校的DaveBeebe團隊開發了一系列基于微滴度板的細胞培養設備，包括3D培養板和趨化板（Berthieretal.，2010）。微滴度板上共有192個單通道被載細胞凝膠填充（Meyvantssonetal.，2008）。利用不同大小的液滴在入口和出口處的差半月板壓力，在凝膠間進行了間隙流。類似的泵浦概念被用于49通道網絡趨化裝置，由一個源通道和一個匯通道連接到一個非常薄的梯度通道。荷蘭MIMETAS公司ZJIN推出了OrganoPlate，由40到96個單獨可定位的微流網絡組成（Jang等人，2015；Moreno等人，2015；Trietschetal.，2013）。OrganoPlate利用PhaseGuide技術將細胞外基質（ECM）凝膠有序分層，一層接一層。這使得一種完全不需要人工膜的共培養方法成為可能，同時仍然能夠進行組織工程。有機板完全沒有高吸光度物質，如PDMS，不需要任何其他操作設備，除了標準移液器，并通過被動流平提供連續灌注流。

麻省理工學院（Cambridge,USA）的LindaGriffith小組將基于平板的微流體細胞培養模式引入肝臟模型，并由CNBioInnovations（London,UK）商業化。Liverchip?系統是一種基于平板的系統，下面將詳細描述。在過去的十年中，一波單器官芯片的概念被提出，涵蓋了廣泛的組織，并被積極地引入生物學研究。他們從不同器官特異性的單細胞類型培養開始，如內皮細胞（YoungandSimmons,2010）、成肌細胞（Guetal.，2004）、肝細胞（Carraroetal.，2008；Goraletal.，2010；Hoetal.，2006；Leclerc等人，2004年；李等人，2007b；Park等人，2008；鮑爾斯等人，2002年；Toh等人，2007；Tohetal.，2009）、神經元（Rheeetal.，2005）、乳腺上皮細胞（Graftonetal.，2011）、脂肪細胞（Nakayamaetal.，2008）和人類胚胎細胞（Chungetal.，2005；洪在al.，2005a；Smith等人，2012；Villa-Diaz等人，2009）。因此，在下一階段，異型微流控單器官共培養系統將特定器官的關鍵細胞類型結合到人工功能單元中，更真實地反映了單個器官的各個方面。在過去五年中，器官芯片模型領域的科學活動急劇增加（vandeStolpeetal.，2013）。因此，我們決定以典型的方式強調用于人類肝臟和肺建模的單器官MPS開發，同時讓讀者參考其他器官和系統的原始MPS文獻。基于mps的肝臟培養已經從動態隨機細胞培養成熟到組織復雜度更高的系統。肝臟對機體穩態（如血漿蛋白合成、葡萄糖生物轉化）和血液解DU（如尿素、外源性藥物代謝）具有獨特的重要性，這導致了人類肝臟結構在其ZXIAO功能單位——肝小葉的規模上的進化優化。沿著500μm長的約25個以繩狀排列的肝細胞進行精確的分區分工，使血液接觸時間僅為幾秒鐘即可進行血液解DU。血漿與肝細胞接觸的流體動力學知之甚少。在Disse空間的等離子體流動的性質和應用于這些基底外側表面的肝細胞的力學是有爭議的。開窗程度高可能導致流體剪切應力傳遞到肝細胞。此外，門靜脈周圍區的竇道直徑很小，只有紅細胞大小。血細胞通過這些緊密的竇道時還可能調節切應力。到目前為止，已有四種基于mps的肝臟等效物:隨機動態肝細胞單培養、索狀肝等效物、內皮竇模型和肝小葉“等效物”（Materneetal.，2015）。圖6突出顯示了后三種類型的示例。

圖6：受生物學啟發，mps肝模型的復雜性不斷增加。MPS從膽管形成的索狀肝培養(A)，到支持功能空間Disse結構的竇狀排列(B)，再到維持功能器官狀肝結構的組織切片培養(C)。  

與隨機動態肝細胞培養相反，Goral和同事（2010）提出了由極化細胞組成的三維索狀結構，形成延伸的膽管結構。一系列保留柱在兩個側通道之間形成一個微通道（圖6a）。然而，與其他基于灌注的微設備不同，細胞培養室底部的微結構提供了額外的肝細胞極性控制。灌注培養兩周后，細胞仍能存活并形成索狀結構。可以看到膽管結構的延伸和三維結構細胞之間縫隙連接的形成。上述系統允許肝細胞排列成人工的、但類似于索狀的集合，恢復肝細胞極性并支持零星的膽汁分離。肝細胞與非實質細胞在持續灌注的三維空間環境中共培養，可能會形成與體內情況下下一個層次的結構相似。LindaGriffith的團隊在麻省理工學院（Domanskyetal.，2010）開發了一種非常有趣的方法來建模微流控系統中的類正弦結構。多個生物反應器陣列構建在由12個自主微流控系統（圖6b）組成的多孔板中，每個孔板由集成的氣動微泵灌注，循環總容積為3ml。每個組織培養支架包含769個多通道（0.24mm深，106個大鼠肝細胞與內皮細胞按1:1的比例接種。連續可調的氧氣梯度可以建立在長時間的操作時間。支架支持接近生理組織密度和肝細胞功能分區可以規定。支架的大通道支持兩種細胞類型在動態條件下的自組裝。肝竇內皮細胞在體外已失去分化表型，但在整個培養過程中仍保持功能標記物SE-1的表達。基于氧氣消耗模型的可調流量、長期穩定的梯度維持以及肝細胞與不同類型的非實質細胞共培養的能力等重要特性使該系統成為一種有趣的毒性測試方法。這是研究中的多磺酸粘多糖隨后得到改進并轉化為工業應用的罕見案例之一。由CNBioInnovations商業化的這個LiverChip?系統的支架尺寸可以縮放到10,000-1,000,000個細胞，而平板同樣縮放到12孔或36孔格式。主動泵送提供循環，使流經組織的流速與組織的形態分離。該系統為藥物代謝和藥代動力學、毒理學和疾病生物學應用提供高含量數據（Sarkaretal.，2015；Vivares等人，2015）。它已應用于臨床前開發（Dash等，2009；Vivares等人，2015）。此外，在該平臺上建立了肝癌細胞微轉移模型，并在該模型中建立了侵略性MDA-MB-231細胞系休眠的證明（Wheeleretal.，2014）。使用相同的三維灌注肝臟模型也建立了乙肝病毒感染模型。低溫保存的原代人肝細胞通過與病人血清孵育而感染。概述了病毒的整個生命周期，使該模型在探索乙型肝炎病毒的基礎生物學和評估新的治ZHI療方法方面發揮效用（Waietal.，2014）。

建筑的ZGAO水平-整個肝小葉尚未達成,但是芯片微流控方法包含的主要部分已由肝小葉vanMidwoud和他的同事們（van Midwoudetal.,2010）,培養3毫克的肝臟切片組織的微流控芯片（圖6c）。精密切割的肝切片（厚100μm，直徑4mm）在恒定pH和溶解氧的培養箱中以10μl/min的流量灌注。在靜態培養3小時以上的對照切片中，生物轉化活性是相等的。在三個小時的測量時間內，該系統在代謝功能方面沒有顯示出任何優勢。作者強調了在低組織-液體體積比下連續介質灌注的優勢，相對于靜態培養中穩定的代謝物積累。不幸的是，目前還沒有關于超過72小時的培養表現的數據（vanMidwoudetal.，2011a）。

除了上述例子，基于mps的單器官肝臟建模已經導致了大量的芯片肝臟設備（Baudoinetal.，2014a；Hwaetal.，2007；凱恩等人，2006年；Khetani和Bhatia,2008；Leclerc等人，2014；Leclerc等人，2015；Legendreetal.，2013；Legendreetal.，2014；Pasirayi等人，2014；研究工具和分析已經開發出來，用于研究單器官芯片的肝臟代謝和毒性（Baudoinetal.，2014b；Leclerc等人，2014；Leclerc等人，2015；Legendreetal.，2013；Legendreetal.，2014；Pasirayi等人，2014；Snouber等人，2013a）。關于芯片上肝臟模型閱讀器開發的更多細節，請參閱各自的綜述（Materneetal.，2013；vanMidwoud等人，2011b）。

圖7：應用機械拉伸的仿生微流控肺泡模型。(A)本機和拉伸狀態下的設備橫截面圖。 膜的頂部培養人肺泡上皮細胞，膜的底部培養人肺微血管內皮細胞。 (B)肺視圖，顯示吸氣時空氣的伸展和由此產生的分布。 通過側腔施加循環真空使細胞層拉伸，模擬吸氣時的自然拉伸。 轉載自Huh等人(2010)。  

另一個復雜的器官是人類肺，受生物學啟發的mps模型已經在理解人體器官功能、測試安全性和建模疾病方面發揮了作用。人類小氣道和肺泡的體外模型是在細胞培養插入物上靜態氣液界面培養的歷史。對于這些模型的全面概述，讀者可以參考Gordon及其同事Z近的t4報告（2015）。直到Z近，只有少數試圖模擬肺功能部分的MPS被開發出來（Nalayandaetal.，2007；Nalayandaetal.，2010），但是在2010年，由美國馬薩諸塞州波士頓哈佛大學Wyss生物啟發工程研究所的DonaldIngber小組開發的微生理芯片肺系統S次登上了《科學雜志》（Huhetal.，2010）。圖7a顯示了這個模擬肺泡功能的系統的設計和原理。該系統是通過微制造兩個微通道的腔室來制備的，兩個微通道之間由涂覆纖維連接蛋白或膠原蛋白的薄（10μm）多孔PDMS膜隔開。膜上培養人肺泡上皮細胞（上通道），膜下培養人肺微血管內皮細胞（下通道）。空氣通過頂部通道泵入，培養液作為血液的替代品通過下部通道泵入。因此，該系統是模擬肺泡-毛細血管屏障。通過在側通道上施加真空，可以拉伸培養層；真空的釋放引起薄膜的彈性反沖，使其回到自然狀態，模擬呼吸時肺泡的拉伸（圖7b）。空氣中的分子通過被動擴散和主動運輸的結合穿過培養液層，如肺中的肺泡。Huh和他的同事（2012）使用他們的芯片肺系統開發了一個肺水腫模型。肺水腫是一種危及生命的疾病，與各種疾病或劑量限制藥物毒性引起的靜壓或微血管通透性增加有關（Willett,2014）。Huh和他的同事（2012）證實，給高劑量的白介素-2（IL-2）在他們的芯片肺系統中引起了一種與肺水腫一致的狀態，類似于給人類癌癥患者使用IL-2的效果。他們還發現，血管生成素-1和GSK2193874（一種瞬態受體電位香草醛離子通道抑制劑）可在體外減輕水腫，并可能在臨床環境中阻止IL-2的這種劑量限制毒性。作者得出結論，該系統可以用于其他器官的疾病模型，并預測其他藥物在人類中的療效和毒性。仿真公司（波士頓，美國）正在將基于該平臺的工具商業化。該系統還被用于檢測細胞內活性氧（ROS）對納米顆粒的反應（Huh,2015；Huhetal.，2010）。

在這些研究中，直徑為12納米的二氧化硅納米顆粒誘導并放大了根據活性氧生成測量的急性毒性反應。循環拉伸和松弛多孔膜以模擬呼吸，進一步增強了二氧化硅納米顆粒從上層空氣通道到下層流體通道的吸收和轉運。在小鼠全肺通氣灌注模型中也觀察到類似的結果。

其他研究小組已經開發了一種芯片肺系統，使用的是來自接受部分肺切除術（Stuckietal.，2015）患者的人原發性肺泡上皮細胞或原發性氣道上皮細胞（Boletal.，2014；Sellgrenetal.，2014）用于選擇治療肺部病變的候選藥物。Z后，在芯片小氣道模型的基礎上建立了化療誘導的肺水腫模型（Benametal.，2015b）。該系統的主要生物學方面是對細胞施加生理循環應變的應用，這不僅密切模仿正常的呼吸運動，而且影響細胞層的滲透性。體內研究表明，肺的膨脹和吸入一樣，增加了肺對親水分子的滲透性（Marksetal.，1985）。這可能是由于細胞間連接的拉伸，這增加了孔隙的大小，并允許更大的親水分子通過連接（Masonetal.，2001）。開發用于其他類型上皮細胞培養的微流體系統的創新方法也可能適用于建立新的芯片肺系統。關于mps肺模型發展的進一步信息，請參閱Z近的一篇綜述（Nicholsetal.，2014）。盡管一致認為芯片上的肺系統是毒理學研究的有用工具，但很少有人使用這些系統進行毒理學研究。

北京佰司特貿易有限責任公司（https://www.best-sciences.com）：
質量光度計-OneMP；類器官培養儀-HUMIMIC；灌流式細胞代謝分析儀-IMOLA；便攜式4通道SPR儀-P4SPR；藍光/綠光LED凝膠成像；Nanocellect細胞分選儀-WOLF；微納加工點印儀-NLP2000/DPN5000