前沿進展：通過微生理方法解決藥物分子預測難題

—第四屆大西洋毒理學研討會報告（二）-2

Biology-inspired Microphysiological System Approaches to Solve the Prediction Dilemma of Substance Testing

t4 Workshop Report-跨大西洋毒理學智庫的報告，該智庫由Doerenkamp Zbinden基金會贊助，由巴爾的摩、康斯坦茨和烏得勒支的毒理學負責人合作完成。本文所表達的觀點是作者本人的觀點，不一定代表他們的工作機構的觀點。

May 15, 2016

翻譯和整理：北京佰司特貿易有限責任公司

單器官MPS的其他器官模型包括小動脈（Günteretal.，2010）、神經系統（BoothandKim,2012；Brownetal.，2014；Kerman等人，2015；Neryetal.，2015；Parketal.，2009；Tayloretal.，2005），胰XIAN（Silvaetal.，2013；Junetal.，2013；Leeetal.，2012），腎臟（Snouberetal.，2012；斯努伯等人，2011年；zhangetal.，2013；Ferrell等人，2012；KimandTakayama,2015；Huangetal.，2013；Muetal.，2013）、骨SUI（Cuietal.，2007）、皮膚和頭發（Ata?etal.，2013）和腸道（Eschetal.，2012；KimandIngber,2013；Kimetal.，2012；Kimetal.，2013a；木村等人，2008年；Lahar等人，2011年；馬勒等，2009a；McAuliffe等人，2008年；Ootani等，2010；Sato等人，2009；Sungetal.，2011；Yuetal.，2012）在不同層次的生物復雜性。Gao及其同事（2013）設計了一種集成的微流控裝置，直接與質譜儀耦合，以實時表征腸道屏障的藥物滲透性。他們能夠實時測量姜黃素通過Caco-2單層細胞的滲透情況，并獲得與已發表的體內數據一致的結果。另一個集成的微流控平臺“NutriChip”被建立起來，用于研究乳制品免疫調節功能的潛力（Ramadanetal.，2013）。Ramadan和同事在他們的上皮/免疫細胞共培養模型中，使用磁珠和光學檢測設備直接在線量化了促炎細胞因子表達的變化。這些技術為物質滲透性研究或生理反應測量提供了有用的工具。ZZUI后，美國波士頓哈佛大學Wyss研究所的芯片肺平臺Z近被用于炎癥性腸病的芯片腸模型（Kimetal.，2016）。該單器官芯片用于共培養與活的人腸道上皮細胞接觸的多種共生微生物，并分析腸道微生物組、炎癥細胞和蠕動相關的機械變形如何獨立促進腸道細菌過度生長和炎癥。該體外模型復制了過去動物和人類研究的結果，包括證明益生菌和抗生素治ZHI療可以抑ZHI致病菌誘導的絨毛損傷。在維持管腔血流的同時停止蠕動樣運動，缺乏上皮變形可觸發細菌過度生長，這與在腸梗阻和炎癥性腸病患者中觀察到的相似。因此，這種芯片上的人體腸道可以用來分析微生物組對腸道病理生理學的貢獻，并以一種可控的方式解剖疾病機制，這是現有的體外系統或動物模型無法實現的。

排泄系統，我們向讀者推薦Perestrelo和合作者（2015）Z近的一項系統綜述，而使用單器官MPS模型疾病已經在其他地方進行了綜述（Benametal.，2015a）。荷蘭萊頓大學（LeidenUniversity）的Hankemeier及其同事（vanDuinenetal.，2015）Z近對微流控和微工程3D細胞培養系統進行了一項調查，發現2012年至2015年初在MPS領域發表的大多數組織建模工作都集中在血管系統上。作者解釋說，MPS是唯YI能夠灌注此類血管的平臺，因此包括至關重要的血流和伴隨的剪切應力，這是血管建模的顯著優勢。MPS模擬微血管來研究血管生成（Bischeletal.，2013；Zhengetal.，2012）、通透性（Leeetal.，2014）、模式擴散梯度（Bakeretal.，2013）、微血管環境（Hasenbergetal.，2015；Kimetal.，2013b；Parketal.，2014；Tourovskaiaetal.，2014；Wangetal.，2014a）和血管對血管幾何形狀的響應（Yeetal.，2014）已經在過去幾年發展起來。Z后，血管MPS被用作動脈血栓形成的模型（Huhetal.，2007；Westeinetal.，2013）。Hankemeier和他的同事（vanDuinenetal.，2015）調查的另一個重要發現是，在2012年至2015年初發表的微流控癌癥模型與上述微流控組織模型在數值上的份額大致相同。乳腺癌和肺癌模型占已發表癌癥模型的一半，Z近開發的許多癌癥模型都包含血管成分。在這里，MPS技術再次提供了唯YI的平臺，通過將人微灌注三維腫瘤模型與人血管系統相結合，來模擬腫瘤細胞進入替代血流或免疫細胞外滲到腫瘤中。這些系統增加了我們對腫瘤進展的理解。遷移（Haessler等人，2012；Hockemeyeretal.，2014）、體內滲濾（Zervantonakisetal.，2012）外滲（Bersinietal.，2014；Jeonetal.，2013）和轉移（Griepetal.，2013）已經在這種基于mps的腫瘤模型中進行了研究。

2.3.3多器官系統微生理發育

將單器官模型結合到集成的多器官配置中，將復雜性提高到器官相互作用的系統水平。設想使用這種多器官系統來模擬人體器官間的串擾、ADME途徑和器官間的系統調節回路。它們的發展對基于板和芯片的格式都提出了重大挑戰。不同的器官模型必須在同一設備中處理，同時保持完全功能，并通過相同的循環液相相互作用。這些挑戰提高了對使用多器官MPS生成對人類具有可重復性和預測性結果的工具和方法的資格要求。為這些系統模型選擇的任何基于板或芯片的MPS技術都是在復雜性和體內相似性與易用性、重現性和并行化潛力之間的權衡（vanMidwoudetal.，2011b）。瑞士蘇黎世聯邦理工學院和InSpheroAG的OlivierFrey團隊及其合作者率先開發了多器官板概念，使用3D微組織球體作為3D組織模型（Kimetal.，2015a；Kim等人，2015b）。微流控平臺的搭建方式是將微組織發育與微流控培養完全解耦，并以模塊化方式實現橢球加載（圖8A）。平板由直通道組成，連接多達10個相同的隔間，在其中球體可以使用簡單的移液加載。介質通過平臺周期性傾斜，以重力流的方式在兩個橫向介質儲層之間灌注。單個平板包含多達10個通道，因此在單個傾斜裝置上可以測試多達60個多器官條件（圖8B）。人體組織球具有固有的器官型功能和仿生形態，可以在離線自動化系統中精確、可靠、靈活地制造。它們的球形形狀使其易于操作，并使基于板或芯片的MPS易于操作和耐用的發展成為可能。使用橢球體的多器官排列可以以一種非常靈活的方式建立，對于可以形成橢球體的大量細胞類型，以代表不同的器官模型和許多橢球室的流體互聯系統。因此，無需對微流控測試平臺本身進行重新設計，就可以對橢球模型進行不斷改進和進一步發展。雖然在按照生理順序安排不同器官模型以及根據引入系統的球體數量調整不同組織體積和比率方面提供了很大的靈活性，但這種方法的局限性在于球體模型本身。球體通常被認為是ZZUI小的功能組織單位。然而，很明顯，球體不包括機械線索（動態力量，如呼吸緊張），也不血管化。因此，基于球體的多器官模型將主要關注不同組織類型之間的生化和代謝相互作用（例如，將代謝肝臟功能添加到生物激活應用中）。為概念證明（Kimetal.，2015a；Kim等人，2015b）聯合結直腸腫瘤微組織（HCT-116）培養原代大鼠肝組織超過8天。有趣的是，與靜態培養條件相比，在流體設備中，大鼠肝臟微組織的白蛋白分泌在Z初幾天增加，這表明在芯片中流動條件下組織進一步成熟。環磷酰胺是一種前體藥物，需要肝臟代謝（主要是CYP2B6）激活才能發揮作用，通過應用環磷酰胺證明了肝臟和腫瘤組織相互連接的重要性。在靜態培養條件下，采用移液方案進行離散液體轉移，并在芯片上灌注條件下，同時評估環磷酰胺對腫瘤生長的影響。值得注意的是，在靜態培養條件下幾乎沒有觀察到對腫瘤生長的任何影響，而在芯片中直接和連續的流體耦合情況下，環磷酰胺處理后微腫瘤明顯變小。這些發現說明了不同組織或組織間隔間液體和代謝物連續轉移的重要性。在孤立的橢球結構中，這種轉移只能通過頻繁的離散介質交換來實現。然而，適當的轉移時間和足夠長的培養時間來獲得所需的代謝化合物是很難估計和優化的。此外，相對較大的井量的傳統設置可能導致活性代謝物的稀釋過大。在同一孔中共培養球形細胞，增加細胞-培養基體積比，短時間內會導致組織不可控融合。研究結果進一步證明，使用已經是勞動密集型的移液協議的井格式無法再現通過連續介質交換獲得的結果，正如僅包括兩種不同組織類型的設置所示。移液方法不再是需要兩種以上不同組織類型的實驗方案的選擇，因為各自的協議變得非常復雜，而微流控網絡提供了可行的解決方案。這種基于板的MPS技術（InSphero,2012）將由瑞士InSphero公司商業化。

圖8：基于平板的多器官系統的例子(A)、96孔格式的多組織相互作用測試芯片(特寫顯示帶有裝載端口的球形室)。10條平行微流通道連接6個培養室，可裝載不同類型的球體。 (B)、在標準培養箱中操作的平臺，使芯片前后傾斜，在不同培養室之間產生重力引導的流動。 (瑞士聯邦理工學院ETH提供)  

同一組的另一種方法包括使用懸掛滴本身——形成球體的主要技術——作為芯片上培養室（Freyetal.，2014）。懸掛液滴陣列與功能性懸掛液滴網絡相連，介質可在液滴之間灌注，并連接不同類型的球體。該平臺結合了不同細胞類型球形細胞的形成和培養，由于球形細胞位于液-氣界面上，因此不存在粘附和功能喪失的風險。基于陣列的格式能夠進行并行的多組織實驗，并允許重現上述環磷酰胺生物活化研究。芯片上搏動微泵的集成，其卒中率已與人類ips衍生的心臟球體的跳動同步，Z近將心臟“添加到懸掛-滴網絡技術中”（Rismani等人，2015）。

另一種基于平板的系統已被用于研究paracetamol的腸首通代謝和繼發性肝臟代謝，使用CaCo-2和HepG2/C3A細胞共培養超過24小時。（Prot等人，2014）。結果表明，撲熱息痛通過腸道單位運輸，隨后通過肝臟和腸道單位生產硫酸撲熱息痛進行協同代謝。肝共培養時檢測葡萄糖醛酸對乙酰氨基酚。

美國康奈爾大學的michaelShuler小組率先開發了人體多器官芯片（moc）。早在2004年，他們就開發了一種基于芯片的微型微細胞培養模擬物（μCCA），用于藥代動力學/藥效學（PK/PD）建模（Sinetal.，2004）。該系統支持基于生理的藥代動力學、定量構效關系（QSAR）研究和定量體外到體內外推（QIVIVE）建模。它將不同的人體組織培養物組合成一個共同的培養基流，用于預測親代化合物及其代謝物的時間依賴性濃度。系統的原理設計如圖9所示。它依賴于普通培養基的再循環，每個培養室約有10,000個細胞，接觸物質的次數可達4天。

圖9：芯片尺寸為25 × 25 mm，通道寬度為20 ~ 100 μm。  流動是層流的，通常每個組織培養室有超過10,000個細胞。 該設計基于哈根泊Poiseulle定律，允許將每個通道中的類人流體速度和液體在每個隔間中的停留時間與硅中的PKPD模型相匹配。 (Marx等人2012年修改)  

萘作為模型毒物的研究證明了這一概念（Viravaidyaetal.，2004）。此外，兩種使用阿霉素（TatosianandShuler,2009）和替加呋（SungandShuler,2009）的聯合療法已經在μCCA的人體癌細胞株上進行了測試，這是專門為物質檢測應用而開發的。在選定的規模下，該系統提供了培養室之間的類體內組織質量比，培養基流入分裂，相當于人體各自的血流分裂，以及相關的組織間隔停留時間。此外，該微流控芯片設計據稱支持生理剪切應力和液體與細胞的比率，模擬各自的器官。它的運行周期可長達四天。該平臺由美國Hμrel公司商業化。μCCA的布局多年來一直在發展（Mahleretal.，2009a；馬勒等人，2012；馬勒等，2009b；Sungetal.，2010；songandShuler,2010）。2012年，將μCCA技術推進為常規檢測分析平臺，總結了以下問題（Shuler,2012）:

---采用基于重力的介質流的“無泵”芯片設計，避免任何泵系統；

---監控外圍的改進；

---有關的機械力或電耦合的維護；

---改進普通培養基，使之成為更逼真的代血劑；

---從3D人類細胞系構建到初級人類類器官的細胞培養室的器官典型性改進，解決其特定的ECM結構、上皮屏障、基質組織影響、生理吸收和水的分泌或蒸發動力學。

Shuler的團隊Z近提出了一種基于μCCA平臺的雙器官芯片，通過CaCo-2細胞和粘蛋白產生細胞系TH29-MTX的共培養模擬胃腸道，通過HepG2/C3A細胞系培養模擬肝臟（Esch，2014）。這個腸肝芯片暴露在納米顆粒中24小時。結果表明，攝入羧基化聚苯乙烯納米顆粒有可能導致系統肝損傷。下一步，MichaelShulers小組開發了一種用于毒性測試的四器官芯片（Oleago，2016）。Z近介紹了一種低成本無泵重力驅動流動系統，用于在一個共同定義的培養基中維持人類心臟、肝臟、骨骼肌和神經元的存活和功能培養兩周。選擇這些細胞類型是為了深入了解人體組織在應對阿霉素、阿托伐他汀、丙戊酸、對乙酰氨基酚和n-乙酰氨基酚等具有明確毒理學特性的挑戰時的重要代謝和功能變化。所提供的數據顯示了所有4種人類細胞類型在流動培養14天期間的存活和持續功能，以及它們對單劑量48小時藥物暴露的反應。所有藥物治療的結果與已發表的人類和動物數據的毒性結果基本一致。所提出的表型培養模型顯示了多器官毒性反應，并向體外“人-芯片”全身毒性篩選試驗邁出了一步。Shulers實驗室開發的ZZUI新原型是一個10個器官的原型，在本報告的第4章中說明。針對不同人體組織在芯片上的系統排列的一系列其他moc已經出現。μOrgano是一種可定制的、類似樂高的即插即用系統，它可以使單個器官芯片系統的初始個體培養和隨后的連接創建集成的多器官微生理系統（2015）。作為概念的證明，μOrgano系統被用于串聯多個心臟芯片，具有良好的細胞活力和自發的生理跳動率。多組織排列的實驗正在進行中。Zhang和來自新加坡生物工程與納米技術研究所的同事開發了一種多通道3D微流控細胞培養系統，提供了四個獨立的基于通道的細胞培養空間，每個空間可以裝載數萬個細胞（Zhang，2009）。將人肝、肺、腎細胞系和原代人脂肪細胞排列在直接剪切應力屏蔽的微通道中，模擬內皮壁在體內的剪切應力保護。再循環流速為0.2mL/min，暴露時間為2天，轉化生長因子β1可導致人肺細胞的獨立生物學反應，而其他室則未受影響。Imura和應用生物化學系的同事報道了另一種用于模擬人乳腺癌細胞的腸道吸收、肝臟代謝和毒性反應的綜合系統解決方案，該方案使用了常用的四種藥物，東京大學農業和生命科學學院（Imura，2010）。他們的系統提供了芯片格式的單向流動，即顯微鏡載玻片的面積。它支持數以萬計的人HEPG2細胞系為基礎的肝細胞和人MCF-7細胞系為基礎的人乳腺癌細胞連續排列在一個微通道中進行持續灌注。藥物通過一個緊密封閉的人cco2細胞系腸道上皮細胞單層提供到肝腔室前通道的介質流中，模擬人體腸道的吸收特性。在0.4μL/min的流速下，暴露時間為2天，對人乳腺癌細胞有離散的生物學效應。異環磷酰胺的腎毒性在肝-腎共培養MPS中進行了超過72小時的研究，與靜態比較（Snouber，2013b）。結果表明，在HepaRG-MDCK細胞肝腎微流控共培養模型中，異環磷酰胺的腎毒性是由異環磷酰胺代謝成氯乙醛引起的。本研究展示了多器官系統檢測次生代謝物毒性的能力，結合了以人細胞系為基礎的肝臟模型和第二個靶器官，在本例中是腎臟。

Gordana Vunjak-Novakovic和她的同事正在開發一種HeLiVa多器官平臺，該平臺具有從單系人類多能干細胞衍生出來的功能連接血管、肝臟和心臟微組織（Vunjak Novakovic等，2013）。從一個供體來源獲得多器官系統所需的所有細胞類型的能力是向具有免疫能力的多器官系統發展的一個非常重要的先決條件，以避免該系統中由于供體不相容而產生的器官排斥。該平臺能夠結合實時生物讀數（通過所有三種細胞表型的成像和同源報告）和高通量/高含量分析的兼容性，實現人體生理學的功能表征。用于血管、心臟和肝臟微組織形成和培養的微流體平臺的首批原型目前正在評估中，以證明人類iPS細胞衍生的微組織在生理和藥理研究中的效用。

為了克服在上述所有泵基moc中使用外部泵和儲液器所造成的非生理流體-組織比，柏林科技大學的UweMarx團隊和他們的合作者在顯微鏡載玻片區域的標準化芯片格式下設計并原型化了MOC平臺（圖10），該平臺配備了一個強大的芯片上蠕動微泵，由Wu和同事（2008）改進。

圖10：多器官芯片平臺（A）一個3毫米高的PDMS芯片（黃色），連接在顯微鏡載玻片上，承載兩個獨立的微電路，其循環通道為100 × 500 μm。 每個通道連接兩個組織培養室，支持3D組織的整合，如細胞球體和標準96孔插入重建屏障器官模型。蠕動式片上微泵（黑色）可實現生理頻率下的脈動單向流體流動。 （B）代表兩個血流灌注的回路。（轉載自Marx等，2012年）  

它支持介質通過一個、兩個或更多的組織培養室以接近活體速率和脈沖頻率的脈動再循環。此外，該MOC平臺的器官培養室普遍支持3D細胞球體的培養，重建的組織等效物，如培養小室的皮膚或腸，以及供者來源的組織外植體或活檢組織。該平臺旨在使共培養的人體器官模型在至少28天內保持長期穩態，以實現全身重復暴露于藥物中。可以建立一個健壯的、可重復的28天人類HepaRG-Stellate細胞球體與基于插入的人類皮膚活檢相連接的共培養過程，每個球體的生物量是原始人體器官對應的1/100,000（Wagner，2013）。在片上共培養過程中，可在氣液界面維持皮膚功能。此外，系統中總液體-組織比支持組織串擾，這可以從皮膚消耗肝組織產生的白蛋白看出。Z后，共培養顯示了對重復劑量暴露宇曲格列酮（一種因藥物致肝損傷而退出市場的糖尿病藥物）6天的劑量依賴性毒性反應。另一種使用MOC平臺的雙器官共培養旨在將描述的3D肝臟模型與商業可用的重建人3D小腸模型相結合（Maschmeyer，2015a）。與CaCo-2屏障相比，這旨在增加屏障的人體器官類型，并提高其穩健性和工業適用性。在為期3天的無給藥適應期后的11天內，采用了一種可重復且易于執行的口服物質給藥de方案，從而在重復劑量試驗條件下獲得連續兩周的MOC表現。免疫組化轉運蛋白、屏障完整性的經上皮電阻測量和基因表達分析顯示，腸屏障功能穩定，而曲格列酮治療降低了肝球體中白蛋白mRNA的表達。

使用同一平臺反復將人肝臟和神經元球體與己二酮進行長期共培養（Materneetal.，2015）。因此，將上述肝球體與人神經元球體共培養14天，使用NT2細胞系在攪拌槽生物反應器中預形成并分化，每天暴露于不同劑量的己二酮中，持續8天。共培養的敏感性譜可以與單器官芯片的反應進行比較，顯示出更高的敏感性水平。Z后，在生理流體流動條件下，建立了將生物血管系統集成到MOC平臺微流體通道中的健壯程序（Schimek，2013）。因此，MOC平臺適合于結合人原代或基于細胞系的3D微組織在穩態條件下長期重復劑量物質評估。該產品由德國柏林TissUse公司商業化。快速原型工具允許對moc進行靈活調整以適應任何新格式。因此，28天四器官共培養Z近已建立在MOC格式，旨在人類器官型ADMET測試芯片（Maschmeyer，2015）。重建的人小腸與肝球體模型、氣液界面皮膚活檢和人近端小管細胞單層屏障連接。在28天的共培養過程中，所有的人體組織都保持了較高的細胞活力和離散的生理組織結構。人小腸上皮形成穩定的三維絨毛狀結構，高度可達270μm，頂端呈刷狀。皮膚活組織檢查在氣液交界面發現成層角質層。人近端小管上皮維持功能性極化單層屏障。小腸和腎近端小管細胞屏障能夠在腸腔、代理血液循環和排泄循環之間保持持續穩定的葡萄糖梯度平衡。此外，深入的代謝和基因分析顯示，在所有四種組織之間至少28天內建立了可重復的穩態，獨立于用于每個器官當量的單個人類細胞系或組織供體背景。該四器官芯片被設計用于支持物質的ADME分析以及候選藥物的重復劑量全身毒性測試。對生理吸收、S次通過代謝、藥動學和藥效學參數，如有效濃度、ZZUI大耐受劑量、時間過程、治療和不良反應的強度進行評估。Z后，該系統可能支持腸和皮膚室的損傷和再生的研究，因為它們在系統中穩定的生理周轉。UweMarx實驗室MOC的下一步發展是一個10個器官的原型，見本報告第4章。

麻省理工學院的Linda Griffith實驗室和哈佛大學Wyss研究所的Donald Ingber實驗室正在開發其他集成兩個或兩個以上器官的多器官系統，由美國國防部高級研究計劃局/國家衛生研究院/食品和藥物管理局資助。兩組患者都向項目評估委員會成功地證明了幾種雙器官芯片變異（如MIT肝/免疫、腸道/免疫、子宮內膜/上皮和肺/氣道MPS）。此外，麻省理工學院團隊Z近向DARPA/NIH/FDA提交了一個四器官平臺的進展，該平臺實現了兩周的生存能力和功能。美國國防部高級研究計劃局/美國國立衛生研究院/美國食品和藥物管理局的計劃在本報告的第4章中有更詳細的描述，這是在開發人體芯片平臺的背景下，旨在在體外模擬人體生物學的有機體復雜性。

北京佰司特貿易有限責任公司（https://www.best-sciences.com）：
質量光度計-OneMP；類器官培養儀-HUMIMIC；灌流式細胞代謝分析儀-IMOLA；便攜式4通道SPR儀-P4SPR；藍光/綠光LED凝膠成像；Nanocellect細胞分選儀-WOLF；微納加工點印儀-NLP2000/DPN5000