從設(shè)置到數(shù)據(jù)分析的整個細(xì)胞培養(yǎng)過程實現(xiàn)自動化。在機(jī)器學(xué)習(xí)的支持下，自動化工作流程使檢測更加可靠和可重復(fù)。

通過標(biāo)準(zhǔn)化的基質(zhì)膠點(diǎn)樣和類器官傳代實現(xiàn)復(fù)雜腸道類器官工作流程的自動化。

基于成像的形態(tài)測量可用于觸發(fā)程序中的下一步 ( 例如傳代 )。

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機(jī)器

功能強(qiáng)大的全新 CellXpress.ai 體外模型智能化工廠通過整合培養(yǎng)箱、液體工作站和基于圖像決策的人工智能軟件，可自動完成整個細(xì)胞和類器官的培養(yǎng)過程。這種自動化解決方案利用定期成像和分析來監(jiān)測細(xì)胞模型的開發(fā)，管理繁瑣的換液和傳代過程，并利用機(jī)器學(xué)習(xí)實現(xiàn)自動決策，從而啟動下游傳代、終點(diǎn)檢測或故障排除步驟。

在 ImageXpress Confocal HT.ai 智能化共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng) (Molecular Devices) 上，使用 MetaXpress 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件采集熒光 (FL) 圖像。對于腸類器官，利用共聚焦模式，在 4X 或 10X 下采集 Z-stack 圖像，通過 MetaXpress 或 IN Carta 軟件進(jìn)行圖像分析。

使用既定方法 (STEMCELL Technologies) 從原代小鼠腸細(xì)胞中提取并培養(yǎng) 3D 腸類器官 *。根據(jù) STEMCELL  Technologies  的實驗步驟對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和分化，加入 IntestiCult 類器官生長培養(yǎng)基 ( STEMCELL 技術(shù) )，將細(xì)胞以 24 孔板形式接種在生長因子減量 50% 的  Matrigel 或 Cultrex (Corning) 圓頂中，每隔一天更換新鮮培養(yǎng)基。培養(yǎng) 7-10 天后，將腸類器官傳代解離并重新鋪板至新鮮的基質(zhì)膠圓頂中。

圖 1 CellXpress.ai 體外模型智能化工廠的組件和功能。

根據(jù) STEMCELL Technologies 推薦的小鼠腸類器官基本方案， 在 24 孔板中，每孔加入 40-50μl、50-60% Matrigel 或 Cultrex，在基質(zhì)膠圓頂中進(jìn)行類器官培養(yǎng)和傳代。

鋪板接種：將基質(zhì)膠中的類器官懸浮液置于預(yù)冷的 96 孔深孔板中，用 4 個移液管吸頭吸干懸浮液，并分裝到 24 孔板中，每次 4 個吸頭。另外，我們也測試了普通 96 孔板。

換液：培養(yǎng)基的去除和新鮮培養(yǎng)基的添加，一次 4 個孔。

類器官成像 / 監(jiān)測：使用 CellXpress.ai 體外模型智能化工廠完成 2X 或 4X 物鏡下的透射光成像后，利用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的分析方法進(jìn)行圖像分析。這里主要分析評估類器官的數(shù)量、平均面積和總面積、密度以及其他參數(shù)。每 4 天傳代一次，或根據(jù)用戶需要設(shè)置，或根據(jù)一個或多個選定的參數(shù) ( 如總面積或類器官密度 ) 進(jìn)行自動決策。

類器官傳代：對于類器官傳代，我們針對小鼠類器官的工作流程優(yōu)化了移液和離心的組合步驟。流速、移液步驟和重復(fù)次數(shù)、離心速度等可通過參數(shù)微調(diào)進(jìn)行個性化定制。傳代時，先移除培養(yǎng)基，將基質(zhì)膠圓頂與溫和的細(xì)胞解離試劑一起孵育后，反復(fù)吹打破壞基質(zhì)膠圓頂。隨后將混合物收集到 96 深孔板中，然后將兩個孔合并成一個孔，在外置離心機(jī)上 400g 離心 5 分鐘。接著將板放回，去掉培養(yǎng)基，沖洗類器官一次。第二次離心后，吸掉大多數(shù)上清，然后使用小吸頭反復(fù)吹打破壞類器官。最后加入新鮮基質(zhì)膠到適當(dāng)體積，混合成細(xì)胞懸液后接種到新板中。

類器官染色 / 成像：類器官染色后使用 ImageXpress Confocal HT.ai 智能化共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光成像。

圖 2 類器官自動化培養(yǎng)和傳代方案示意圖。

圖 3 類器官培養(yǎng)和傳代的主要步驟。

包括接種、培養(yǎng)基交換、腸類器官的監(jiān)測和傳代是使用預(yù)先設(shè)定的方案“ 階段 ”進(jìn)行編程的。

第一階段是接種，該階段可對將基質(zhì)膠類器官放入 24 孔板的步驟進(jìn)行編程。

程序的下一階段包括更換培養(yǎng)基 / 監(jiān)控 / 傳代步驟，時間及參數(shù)由用戶定義。

圖 4 類器官培養(yǎng)和傳代軟件設(shè)置。

我們持續(xù)培養(yǎng)腸道類器官已超過一個月。類器官基質(zhì)膠圓頂?shù)淖詣咏臃N可實現(xiàn) 24 孔板中圓頂?shù)囊恢麓笮『途_居中，從而使成像和圖像分析更輕松、更準(zhǔn)確。類器官在自動化培養(yǎng)過程中按預(yù)期生長，形成符合典型腸道類器官形態(tài)的隱窩結(jié)構(gòu)。孔間的類器官分布和數(shù)量一致。每天使用 2X 物鏡拍攝圖像，并使用預(yù)訓(xùn)練的機(jī)器學(xué)習(xí)模型。圖像分析可以識別類器官，也可以確定類器官的數(shù)量、平均面積和總面積、類器官密度、圓度、顆粒度和其他形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)。該軟件允許在培養(yǎng)過程中查看類器官圖像，還可提供動態(tài)分析和表示各種測量的時程圖。數(shù)據(jù)也可以導(dǎo)出到 Excel 數(shù)據(jù)表中，以進(jìn)行額外分析。圖 6 顯示了隨時間推移類器官面積和數(shù)量的變化。

圖 5 A. 在連續(xù)培養(yǎng)的不同時間點(diǎn)拍攝的類器官代表性圖像  (4X)。B. 類器官分析圖示：類器官計數(shù)和隨時間推移產(chǎn)生的偏度。偏度是包括光密度、粒度和其他光學(xué)參數(shù)的組合，該值在定義類器官傳代時間方面非常有用。C. 單個孔的類器官圖像隨時間的變化，顯示“ 細(xì)胞進(jìn)程 ”。D. 24 孔板類器官圓頂?shù)?4x 圖像拼接。

圖 6 隨時間變化的類器官計數(shù)和類器官面積總和。根據(jù) 24 個孔計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

 總結(jié) 

? 類器官技術(shù)被認(rèn)為是疾病建模和藥物篩選的改變者，因為它們更類似于組織結(jié)構(gòu)和功能，并對藥物表現(xiàn)出更具預(yù)測性的反應(yīng)。

? 如檢測復(fù)雜性、缺乏可重復(fù)性以及擴(kuò)大篩選規(guī)模的能力，這些挑戰(zhàn)限制了類器官作為藥物發(fā)現(xiàn)的主要篩選方法的廣泛應(yīng)用。

? 在這里，我們展示了研究人員如何緩解勞動密集型復(fù)雜方案帶來的瓶頸，以提高藥物篩選的效率。

? CellXpress.ai 體外模型智能化工廠是一個功能強(qiáng)大的全新解決方案，可使實驗室實現(xiàn)從實驗方法設(shè)置、篩選到數(shù)據(jù)分析的整個細(xì)胞培養(yǎng)過程的自動化，并且通過機(jī)器學(xué)習(xí)驅(qū)動的工作流程使檢測更加可靠、可重復(fù)。

? 以成像和機(jī)器學(xué)習(xí)控制決策為動力的自動化細(xì)胞培養(yǎng)具有巨大的潛力，通過提高生產(chǎn)量和可重復(fù)性，將三維生物學(xué)提升到一個新的水平，進(jìn)而推動高通量藥物發(fā)現(xiàn)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的應(yīng)用。