肝臟是人體中最大的器官之一，來源于內(nèi)胚層中前腸上皮細胞發(fā)育而來的肝芽結構，以代謝功能為主，發(fā)揮“解毒”作用。肝功能失衡會導致稱為肝衰竭的病理狀況，并導致肝炎、纖維化、肝硬化、癌癥、代謝或自身免疫性疾病。因此，為充分了解每種肝病的表型和損傷器官的機制，我們需要體外個性化肝模型系統(tǒng)進行疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和藥物毒性學習。

肝臟類器官(hepatic organoids, HLO, HO)是肝臟功能的3D模型，保留了肝細胞的主要生理特征。在存在或不存在基質(zhì)的情況下，可以從iPSC、ESC或特定的成體細胞（例如上皮細胞或上皮細胞和間充質(zhì)細胞）生成類器官。

我們根據(jù)JCI Insight^[1]、Cell Metab^[2]和J Hepatol^[3]發(fā)表的三篇文章，整理了由人類誘導多能干細胞(human iPSCs)生成肝臟類器官的培養(yǎng)方案。

圖1.iPSC分化為肝類器官的過程(PMID: 28878125)^[1]

A：iPSC分化為肝類器官的示意圖；B-C：在第0天(iPSCs)、第3天（定形內(nèi)胚層，EN）、第6天（前腸，F(xiàn)G）、第9天（成肝細胞，HB)、第20天(HO1)和第62天(HO2)在HO發(fā)育過程中發(fā)生的形態(tài)學和細胞標記變化。

iPSC在含有5 mM EDTA和10 mM Y-27632的緩沖液解離為單個細胞，接種到低吸附的6孔板上，然后用含有激活素A (100 ng/mL)和BMP4 (10 ng/mL)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3天；

更換為含有2% Matrigel和B27的RPMI培養(yǎng)基；第3 -6天，培養(yǎng)基中加入50 ng/mL FGF10；第6-9天，培養(yǎng)基中加入10 ng/mL FGF10和10 ng/mL BMP4；

第9天后，更換為含有1% Matrigel、50 ng/mL HGF、50 ng/mL oncostatin M和10 μM Dexamethasone的類器官生長和分化培養(yǎng)基(HCM)中。

 圖2.iPSC分化為肝類器官的過程(PMID: 31155493)^[2]

A：iPSC分化為肝類器官的示意圖；B：在第0天(iPSCs)和第20天(HLO)明場圖像。

在第20天收集培養(yǎng)物，將細胞解離，200 g離心3 min收集細胞，重懸于50 μL GFR-Matrigel中，接種到24孔板中。Matrigel凝固后，加入1 mL生長培養(yǎng)基(RPMI-1640, B27, 250 nM LDN-193189, 3 μM CHIR99021, 10 μM A83-01, 100 ng/mL EGF, 10 ng/mL FGF10和20 ng/mL HGF)，培養(yǎng)細胞6天，更換為分化培養(yǎng)基(HCM medium, 10 μM DAPT, 10 ng/mL oncostatin M, 20 ng/mL HGF, 10 μM Dexamethasone, 10 ng/mL BMP4)再培養(yǎng)6天。

[1] Guan Y, et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight

. 2017 Sep 7;2(17):e94954.

[2] Ouchi R, et al. Modeling Steatohepatitis in Humans with Pluripotent Stem Cell-Derived Organoids. Cell Metab. 2019 Aug 6;30(2):374-384.e6.

[3] Mun SJ, et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. J Hepatol. 2019 Nov;71(5):970-985.