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ADC“藥王”——HER2 ADC德曲妥珠單抗(DS-8201)的聚集體分析研究

來(lái)源：天津博納艾杰爾科技有限公司      分類：應(yīng)用方案 2024-06-07 15:45:09 70閱讀次數(shù)
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概

述

由于ADC藥物偶聯(lián)的小分子具有一定的疏水性，在生產(chǎn)過(guò)程或者儲(chǔ)存過(guò)程中形成聚集體的傾向有所增加。因此，在放行檢測(cè)測(cè)試和穩(wěn)定性檢測(cè)中，都需要精確和有效的方法來(lái)測(cè)量聚合和碎片。


體積排阻色譜法（SEC）是用于表征蛋白聚集體的標(biāo)準(zhǔn)方法，一般使用磷酸鹽緩沖液作為洗脫溶劑。但使用水性流動(dòng)相對(duì)ADC藥物進(jìn)行SEC分析時(shí)，往往得到的峰形不佳，且聚集體和單體之間的分離度不佳。這可能是疏水性的小分子毒藥和固定相之間的非特異性相互作用引起的。為解決這個(gè)問(wèn)題，我們會(huì)往SEC流動(dòng)相中添加少量有機(jī)改性劑。但有機(jī)改性劑也增加破壞聚集體或者造成色譜柱壽命縮短的風(fēng)險(xiǎn)。因此采用具有高親水性鍵合相和高惰性的柱硬件的SEC柱就顯得尤為重要，因?yàn)楦叨栊缘谋砻鏁?huì)大大減小ADC分子和色譜柱填料和柱硬件之間的次級(jí)相互作用，從而確保色譜峰獲得良好分離且峰形尖銳，且盡可能減少或者避免添加任何有機(jī)改性劑。


Trastuzumab deruxtecan（DS-8201; ENHERTU)是由第一三共和阿斯利康合作開發(fā)的新型HER2靶向ADC。Deruxtecan是毒性藥物DX-8951的衍生物（Dxd）和連接子馬來(lái)酰亞胺-GGFG肽的偶聯(lián)物。


本應(yīng)用使用Biozen的200?孔徑的dSEC-2色譜柱對(duì)DS-8201進(jìn)行聚集體分析。分別考察了兩種規(guī)格（3μm, 7.8mm*300mm和1.8μm, 4.6mm*150mm）的分離結(jié)果。


關(guān)鍵詞


聚集體；DS-8201；SEC；Biozen dSEC-2；BioTi


化合物信息


表1. 化合物信息

中文名稱

CAS號(hào)

分子式

分子量

Deruxtecan

1599440-13-7

C52H56FN9O13

1034.05

Trastuzumab

180288-69-1

N/A

N/A

Trastuzumab-deruxtecan

1826843-81-5

N/A

N/A


實(shí)驗(yàn)部分


1


儀器、試劑與材料


1.1

主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀


1.2

試劑材料

磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鉀為分析純，乙腈為色譜純，屈臣氏蒸餾水


1.3

樣品

Trastuzumab-deruxtecan，DAR值為8。用純水稀釋為濃度為1.0mg/mL

Deruxtecan，濃度為10.34mg/mL，用50%乙腈逐級(jí)稀釋至0.01mg/mL


2


色譜條件


色譜柱1：Biozen dSEC-2 (3μm, 200? 300*7.8mm); P/N: 00H-4788-K0

色譜柱2：Biozen dSEC-2 (1.8μm, 200? 150*4.6mm); P/N: 00F-4787-E0

流動(dòng)相A相：200mM磷酸鉀緩沖液+250mM氯化鉀 pH 6.2

流動(dòng)相B相：乙腈

流速1：0.8mL/min

流速2：0.3mL/min

柱溫：30℃

波長(zhǎng)：280nm

進(jìn)樣量：10μL (柱1)；5μL (柱2)

梯度程序見表2：

表2. 梯度條件

時(shí)間 (min)

流速 (mL/min)

A (%)

B (%)

0

0.8

90

10

30.0

0.8

90

10


3


結(jié)果與討論


3.1

有機(jī)改性劑的比例和選擇

選擇分析抗體類蛋白常用的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相對(duì)DS-8201進(jìn)行聚集體的分離時(shí)，發(fā)現(xiàn)主峰峰形總體來(lái)說(shuō)較為正常，略微拖尾，推測(cè)因?yàn)樾》肿铀幬锏氖杷院虯DC中存在的異質(zhì)性分子導(dǎo)致，聚集體和主峰分離度為2.06。隨后，我們逐步加入不同比例的有機(jī)改性劑，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈的添加比例達(dá)到10%的時(shí)候，聚集體的檢出百分比最高，主峰不對(duì)稱度為1.28。當(dāng)進(jìn)一步增加乙腈的濃度到15%時(shí)，主峰拖尾進(jìn)一步減小，但峰高，聚集體響應(yīng)和分離度都略有降低。當(dāng)用異丙醇作為有機(jī)改性劑，我們發(fā)現(xiàn)色譜柱背壓較乙腈有明顯的增高，所以將流速適當(dāng)調(diào)低。具體結(jié)果參見表3。


圖1. 從上至下分別為DS-8201在不同比例有機(jī)相中的峰形（具體參見表3）。流動(dòng)相條件4流速為0.6mL/min，其余為0.8mL/min。


表3. 流動(dòng)相和積分結(jié)果

流動(dòng)相

主峰不對(duì)稱度

聚集體百分比

理論塔板數(shù)

聚集體分離度

純水相

1.95

0.80%

6726

2.06

添加10%乙腈

1.28

0.89%

11303

2.35

添加15%乙腈

1.17

0.63%

11550

2.26

添加15%異丙醇

1.21

0.49%

11199

2.26


3.2

DS-8201、曲妥珠單抗和Deruxtecan的保留時(shí)

間對(duì)比

因?yàn)镈eruxtecan上含有肽鍵，所以在214nm下有紫外吸收，因此在該波長(zhǎng)下可以觀察到DS-8201、曲妥珠單抗的保留時(shí)間基本相同，大約在9.6min；14.0min左右為buffer峰。Deruxtecan在15.1min左右出峰，可以和DS-8201以及buffer很好的分離。


圖2. DS-8201（藍(lán)）、曲妥珠單抗（黑）和Deruxtecan（紅）的保留時(shí)間對(duì)比


3.3

色譜柱規(guī)格和通量的對(duì)比

本實(shí)驗(yàn)觀察了1.8μm, 4.6*150mm（UPLC高通量）和3μm, 7.8*300mm（HPLC）兩種不同規(guī)格dSEC-2柱的結(jié)果。詳見表4。


圖3. 3μm，7.8*300mm（黑）和1.8μm，4.6*150mm（藍(lán)）的對(duì)比譜圖


圖4. 上圖的局部放大圖

表4. 色譜柱參數(shù)和積分結(jié)果

柱規(guī)格

主峰不對(duì)稱度

聚集體百分比

聚集體

分離度

主峰保

留時(shí)間

3μm, 200?

300*7.8mm

1.28

0.89%

2.35

9.490

1.8μm, 200?

150*4.6mm

1.39

0.77%

1.53

4.053


可以看到使用1.8μm粒徑的dSEC-2柱時(shí)，柱長(zhǎng)從HPLC的300mm縮短為150mm，仍然可達(dá)到聚集體和片段的分離，分析時(shí)間從原來(lái)的20min一針縮短到10min一針。可以使分析通量提高一倍。4.6mm小內(nèi)徑的色譜柱也可以節(jié)約樣品的，減少上樣量，相同的上樣量，小內(nèi)徑色譜柱的色譜峰高為常規(guī)7.8mm內(nèi)徑的2倍。


但是在使用1.8μm小粒徑SEC的時(shí)候有一點(diǎn)需要提醒的是為了達(dá)到柱效的最大化，需要在UPLC儀器上使用，因?yàn)閁PCL的管路死體積足夠小。而4.6mm內(nèi)徑的SEC柱對(duì)于儀器的柱前體積非常敏感，死體積可以引起色譜峰展寬，從而掩蓋碎片的分離。


結(jié)論

在本應(yīng)用使用了Biozen dSEC-2 200?的SEC色譜柱，對(duì)于ADC藥物的聚集體進(jìn)行分析。同時(shí)考察了適合于HPLC和UPLC兩種儀器平臺(tái)的色譜柱，結(jié)果表明都可以對(duì)聚集體和碎片進(jìn)行良好的分離。HPLC SEC是一種抗體類蛋白聚集體檢測(cè)的穩(wěn)健方法可以用于QC放行；而UPLC SEC則可以大大提高實(shí)驗(yàn)通量，特別適合于早期研發(fā)階段樣品量大的情況，節(jié)約研發(fā)人員的時(shí)間。


Biozen dSEC-2的高親水性改性的硅膠修飾技術(shù)使得和ADC分子的次級(jí)作用得到改善，方法開發(fā)簡(jiǎn)單，使用乙腈作為有機(jī)改性劑可以獲得較低的背壓，對(duì)色譜柱更加友好。另外，dSEC-2特有的孔控制技術(shù)也使得這款色譜柱具有柱床穩(wěn)定，耐壓，批次重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。


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