可靠    創(chuàng)新    同行    發(fā)展

類器官是簡單的基于組織工程細胞的體外模型，它概括了體內(nèi)組織的復雜結構和功能的許多方面。它們可以被解剖和詢問，用于人體組織發(fā)育、再生和修復的基本機制研究，也可以用于診斷、疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和個性化醫(yī)療。類器官來源于多能干細胞或組織駐留干細胞(胚胎或成體)，或來源于健康或病變組織(如腫瘤)的祖細胞或分化細胞。迄今為止，已經(jīng)報道了許多支持類器官培養(yǎng)和生長、增殖、分化和成熟的類器官工程策略。本文強調了這些材料和方法的選擇和發(fā)展的基本原理，以控制細胞/組織生態(tài)位;因此，工程類器官的結構和功能。我們還討論了生成健壯類器官的關鍵考慮因素，例如與細胞分離和播種，基質和可溶性因子選擇，物理線索和整合相關的因素。還概述了類器官群落中數(shù)據(jù)質量、可重復性和沉積的一般標準。最后，我們闡述了類器官在不同應用中的局限性，以及未來幾年類器官工程的重點。

干細胞通過細胞更新、遷移、分化和凋亡，在維持器官大小、結構和功能方面起著至關重要的作用。干細胞存在于一個確定的微環(huán)境中，通常被稱為干細胞生態(tài)位，以調節(jié)干細胞的命運。考慮到這些環(huán)境線索的重要性，已經(jīng)有許多組織工程嘗試在體外模擬干細胞生態(tài)位，以實現(xiàn)對細胞-細胞和細胞-基質相互作用的高時空控制，并使用工程水凝膠和微設備復制機械化學線索。1977年，從小鼠肉瘤腫瘤中提取了一種基底膜細胞外基質(ECM)，它含有獨特的ECM成分和生長因子的混合物，并用于體外細胞培養(yǎng)。Matrigel后來被證明可以使乳腺上皮細胞在三維空間中生長，并通過乳蛋白分泌物形成管腔，而嵌入在Matrigel中的成體腸道干細胞在組織特異性生長因子混合物的存在下也被證明可以自組織成三維隱窩絨毛結構。一個多世紀以來，類器官研究與3D細胞培養(yǎng)、干細胞和組織工程交織在一起，在定義、標準和范圍上存在各種爭論。

類器官是一種自組織的3D組織，通常來源于干細胞(多能干細胞、胚胎干細胞或成體干細胞)，并模仿器官的關鍵功能、結構和生物復雜性。包含類器官的細胞可以來源于誘導多能干細胞(iPSCs)或組織源性細胞(TDCs)，包括正常的干細胞/祖細胞、分化細胞和癌細胞。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)和動物模型相比，類器官培養(yǎng)在體外重現(xiàn)體內(nèi)組織樣結構和功能的同時，在模型中具有患者特異性。類器官培養(yǎng)比動物模型更易于操作和深入的生物學研究。因此，類器官培養(yǎng)已被廣泛應用于藥物發(fā)現(xiàn)、個性化伴隨診斷和細胞治療等領域。

類器官培養(yǎng)在細胞組成方面表現(xiàn)出顯著的異質性和可變的復雜性，在自組裝過程中形態(tài)發(fā)生可能受到較差的控制，并且通常缺乏基質、血管和免疫成分。因此，利用我們對器官發(fā)生的理解，以及細胞如何以干細胞生態(tài)位的形式與其細胞和物理微環(huán)境相互作用，來改善類器官培養(yǎng)是非常必要的。基于這些見解，可以開發(fā)生物工程策略來精確控制類器官發(fā)育過程中的干細胞決策。例如，從早期胚胎發(fā)生研究中，我們知道形態(tài)發(fā)生梯度調節(jié)組織模式和發(fā)育。微流體系統(tǒng)可以通過擴散形態(tài)形成因子來產(chǎn)生所需的濃度梯度，從而產(chǎn)生具有空間模式的所需細胞類型。除了生化信號外，干細胞還會經(jīng)歷來自外部微環(huán)境的主動和被動力量，并將這些物理刺激轉化為生化反應。這些物理線索來自基質、外力和/或細胞-細胞相互作用。與依賴天然或生物衍生的ECM(如剛度可調性有限的Matrigel)不同，可以利用合成水凝膠或其他ECM組合來控制基質的物理特性。液體與細胞膜的摩擦也能對細胞施加剪切應力。動態(tài)生物流體環(huán)境對不同類型的細胞有不同程度、方向和頻率的影響。因此，微流體系統(tǒng)和生物反應器可以在微觀和宏觀尺度上提供灌注。最后，現(xiàn)在我們知道細胞與它們的鄰居相互作用，并以集體的方式對外界刺激作出反應。地形線索，如鄰近細胞的曲率和形狀，可以影響干細胞的決定。最近的一個神經(jīng)管模型剖析了折疊過程，并證明了微圖案的幾何約束可以控制神經(jīng)管樣結構的最終形態(tài)。

基于工程細胞的體外模型(如類器官)是否需要忠實地再現(xiàn)體內(nèi)起源器官的結構和功能是有爭議的。一個趨勢是在體外盡可能多地概括體內(nèi)組織結構和功能，以證明日益復雜的模型的生理相關性。對于生物工程師來說，人工創(chuàng)建的體外模型只需要概括體內(nèi)組織的特定特征，與感興趣的生理或疾病功能相關。人們對建立高度復雜的模型并期望它們能準確地模仿體內(nèi)器官的起源持樂觀態(tài)度。對于大多數(shù)用戶來說，更簡單的模型——例如單層或3D培養(yǎng)的一個或兩個細胞的模型——比更復雜的模型(如組裝體或其他多細胞模型)更適用于機制研究和應用。

在本文中，我們重點介紹了建立類器官培養(yǎng)的基本原理，并為不同應用選擇合適的材料和方法提供了指導原則。我們首先討論了建立類器官培養(yǎng)的實驗考慮因素，將其分為四個主要組成部分——細胞、可溶性因子、基質和物理線索——并討論了整合這些成分的方法(圖1)。我們還討論了生成更復雜但更健壯的類器官的關鍵考慮因素，例如與細胞分離和種子、基質和可溶性因子選擇、物理線索和整合相關的因素。還概述了類器官群落中數(shù)據(jù)質量、可重復性和沉積的一般標準。最后，我們闡述了類器官在不同應用中的局限性，以及未來幾年類器官工程的重點。

                                圖1: 類器官工程的組成

建立基于類器官的培養(yǎng)需要考慮構成類器官培養(yǎng)的主要成分——細胞、可溶性因子和基質、物理線索——以及這些成分的成功整合。ASCs，成體干細胞;csc，癌癥干細胞;ECM，細胞外基質;FGF，成纖維細胞生長因子;誘導多能干細胞; OoC organ-on-a-chip; TDCs，組織來源的細胞。

實驗
細胞來源

在規(guī)定的物理化學條件下，從iPSCs、成人或胎兒細胞、干細胞/祖細胞或分化細胞中獲得了小腸、結腸、胃、食道、舌頭、肝臟、肺、胰腺、心臟、耳朵和皮膚等組織。任何給定的類器官的起始細胞群都是至關重要的，它不僅影響所獲得的結構的可變性和異質性，而且還影響他們旨在模擬的組織的功能。為了建立組織源性類器官或癌性類器官，分別通過優(yōu)化的組織分離方法獲得組織駐留干細胞/祖細胞/分化細胞或腫瘤細胞。對于iPSC衍生的類器官，iPSC系被建立，并完全具有起始細胞的特征。通過優(yōu)化的組織分離方法獲得患者/組織來源的干細胞，然后嵌入到模擬干細胞壁龕的3D基質中。iPSCs可以在飼養(yǎng)細胞上維持和擴增為未分化的克隆群體。為了舉例說明組織源性類器官的產(chǎn)生，我們以腸道類器官為例(圖2a)，因為這是第一個建立的組織源性類器官類型7。縱向打開小腸和結腸，清洗，然后切成2-4毫米的碎片，以增加酶消化或進一步機械解離的表面積。EDTA治療用于螯合鈣，破壞細胞-細胞粘附和組織完整性。從收集的隱窩中取出較大的組織碎片和整個細胞，收獲的原代腸隱窩用于播種和產(chǎn)生腸道類器官培養(yǎng)物。

                                      圖2: 流程流程圖

類器官可以由組織源性細胞(tdc)或誘導多能干細胞(iPSCs)產(chǎn)生。為了從tdc中生成類器官，從人類或動物(如腸道和胃)獲得組織樣本。將腸道組織樣本打開、清洗，然后切成小塊(2-4毫米)，以增加酶解或進一步機械解離的表面積，以分離單個腸道干細胞或隱窩。經(jīng)過幾輪清洗和純化后，收獲的干細胞或隱窩將用于播種和產(chǎn)生類器官培養(yǎng)物以進行擴展。b .為了利用基因工程技術從iPSCs中生成類器官，iPSCs被維持和擴增為未分化的克隆群體，并在飼養(yǎng)細胞或定義的細胞外基質(ECM)基質上聚集成胚狀體。通常，多能干細胞以細胞聚集體的形式收獲，這可以保持細胞間的接觸，并產(chǎn)生具有更高活力的細胞群。這些聚集體通過胚層規(guī)范進一步誘導形成內(nèi)胚層球體、中胚層圓頂和神經(jīng)外胚層基質，用于其他應用。

類器官培養(yǎng)的起始細胞群通常從成人或胎兒組織活檢樣本中獲得。最常用的組織解離方法是酶解，它可以溶解ECM45。酶雞尾酒的組成和酶解過程的功效因組織類型而異，在某些情況下，可以添加DNA酶來去除壞死細胞釋放的過量DNA。根據(jù)組織類型的不同，組織片段可以進一步與膠原酶、彈性酶或蛋白酶等酶孵育，產(chǎn)生單細胞懸液，然后在Matrigel中播種。酶解方法可能影響回收細胞的細胞狀態(tài)，因為它可能需要在酶混合物中延長時間來解離大多數(shù)組織駐留干細胞。組織分離也可以機械地實現(xiàn);盡管機械分離更快、更便宜，但細胞產(chǎn)量和活力可能不一致。機械和酶解可以結合起來產(chǎn)生更好的細胞產(chǎn)量。在組織分離后，利用已知的生物標志物或物理特征鑒定和收集用于類器官發(fā)育的TDC。組織特異性干細胞標記通常用于鑒定和分離所需的干細胞以生成類器官。熒光激活細胞分選或磁激活細胞分選基于多個參數(shù)分離細胞，包括大小、形狀和細胞表面標記物表達。其他分離技術包括激光捕獲顯微解剖和人工細胞提取。

iPSCs可以作為未分化的克隆群體維持和擴增許多代。未分化的人多能干細胞通常維持在飼養(yǎng)細胞或確定的ECM基質上。由于單個iPSCs在體外不能很好地存活，iPSCs通常以細胞聚集體的形式收獲，這保持了細胞間的接觸，產(chǎn)生了具有更高活力的細胞群。物理刮削也可以彌補細胞聚集體不均勻性的不足。解離酶混合物的選擇應基于細胞敏感性水平和培養(yǎng)細胞是否分泌過多的ECM，使細胞難以從細胞培養(yǎng)板上分離(圖2b)。

來自活檢樣本或手術切除的腫瘤組織通常也與正常組織類似，以分離腫瘤細胞以生長為類器官。從外周血、腹水和胸腔積液等液體樣本中分離出的腫瘤細胞可用作生成類器官的起始材料。患者來源的腫瘤類器官可以從微創(chuàng)巴氏涂刷材料獲得的樣本中產(chǎn)生。由于腫瘤細胞數(shù)量少，活體組織活檢樣本或液體樣本中的腫瘤細胞可以首先在動物模型中擴增作為異種移植物，以便獲得足夠的細胞用于類器官的生成。在腫瘤組織的情況下，最好限制組織解離，以便分離細胞簇而不是單個細胞。影響腫瘤衍生類器官產(chǎn)生的一個關鍵因素是，從組織中分離出來的細胞通常既含有癌細胞，也含有正常細胞。雖然對某些腫瘤來說，有可能通過排序來富集成瘤細胞，但對于大多數(shù)腫瘤來說，目前還沒有可靠的方法在將正常細胞群和腫瘤細胞群播種到基質中進行培養(yǎng)之前進行分離。克服這一問題的一種方法是利用培養(yǎng)條件，通過使用選擇性培養(yǎng)基來忽略正常類器官生長所需的某些因素，因為腫瘤細胞在惡性轉化過程中逐漸失去對這些因素的依賴。血液污染，特別是紅細胞污染，也會影響類器官的產(chǎn)生和基質的穩(wěn)定性，因此通常使用通過溶解來消除這些污染的標準方法。

基質膠

在細胞分離之后，通常將細胞植入生物衍生基質(如Matrigel)或天然ECM(如膠原)中，或植入合成水凝膠中。基質層主要由層粘連蛋白、IV型膠原、腸動蛋白、纖維蛋白和生長因子組成，其組成與基底膜相似。作為上面使用腸道類器官的例子的延續(xù)，我們現(xiàn)在簡要地描述細胞是如何被封裝成基質的。分離的腸隱窩首先被重新懸浮在冷基質中，然后移液到預熱的低附著孔板中進行培養(yǎng)，產(chǎn)生細胞基質結構的扁平半球形凝膠。腸道類器官培養(yǎng)基的完整組成此前已有報道。類器官通過傳代，通過從基質中分離類器官，去除單個細胞和計數(shù)隱窩來測量增殖率。膨脹率的計算方法是每孔中類器官的數(shù)量除以該孔中Matrigel中初始隱窩的數(shù)量。

盡管Matrigel可以支持類器官培養(yǎng)，但這種生物衍生基質的固有異質性和不明確的組成對改善類器官培養(yǎng)所必需的生化和生物物理時空線索幾乎沒有控制。因此，其他具有明確成分的基質已被探索作為matrix的替代基質，如重組人膠原、纖維蛋白或合成水凝膠。天然基質可以重組地從蛋白質或多糖生產(chǎn)，以解決批次間的差異性Matrigel。另一方面，合成水凝膠已經(jīng)成為一種強大的工具，可以獨立操縱生物化學和生物物理基質特性，以控制類器官特征并增強功能。總的來說，理想的類器官基質應該是應力松弛的，在生化和生物物理特性上是高度動態(tài)的，以適應或控制培養(yǎng)過程中類器官結構的變化。例如，基于聚乙二醇(PEG)的動態(tài)水凝膠最近被證明能夠實現(xiàn)可復制的腸道類器官形成，并展示了如何調節(jié)水凝膠特性來控制培養(yǎng)的類器官的干性和分化。水凝膠的粘彈性也被證明可以定義生長的類器官的機械約束。在其他的例子中，成體干細胞的活性可以用具有光可降解部分的聚乙二醇水凝膠來控制，仿生聚合物可以被修改以結合基本的ECM信號來產(chǎn)生具有定制特征的類器官。可調節(jié)的聚乙二醇水凝膠可促進腸隱窩發(fā)芽，而基于葡聚糖的gmp相容水凝膠可支持細胞延長傳代。最后，微制造陣列最近被報道能夠均勻地產(chǎn)生隱窩絨毛狀上皮。即使使用合成基質生長類器官取得了最近的進展，合成基質生長類器官的效率仍然低于基質培養(yǎng)的類器官。開發(fā)更好的矩陣的需求尚未得到滿足。

類器官可以從單細胞產(chǎn)生的圓形菌落或最初的多細胞結構(如腸隱窩、細胞聚集體或微花紋細胞中產(chǎn)生。后一種方法的目的是建立一個細胞生態(tài)位，從一開始就包括其他相同或不同類型的細胞。要形成細胞聚集體，最簡單的方法是使用涂有親水性水凝膠的超低附著皿，以防止細胞附著;隨后的離心可以促進聚集體的形成，增強細胞間的接觸。細胞聚集體的大小和壓實可以調整和控制，例如通過使用微孔陣列。另一種成熟的形成細胞聚集體的方法是懸掛滴法，在滴的底部形成聚集體。在最近的一個例子中，液滴微流體被用于聚集小鼠膽管細胞，形成與肝間充質細胞復雜的類器官。液滴微流體可以每孔打印一個類器官，并且能夠快速生成類器官內(nèi)的異質性。基于微流體的微流體技術也被用于在不同發(fā)育階段對腸道類器官細胞進行更好的單細胞RNA測序(scRNA-seq)分析，揭示了廣泛的群體異質性。微孔結構或微制造柱陣列也被開發(fā)出來，以增強細胞聚集的均勻性。在一個例子中，微制造的Laminin-512模式被證明可重復地支持人類多能干細胞在Matrigel中形成管腔結構并分化為人類神經(jīng)管樣結構。這些例子，以及其他在該領域出現(xiàn)的例子，說明了我們?nèi)绾瓮茢嗌锊牧虾徒M織工程的知識，以提供對類器官結構和功能的精確控制。

溶性因素

類器官培養(yǎng)基本上是基于我們積累的發(fā)育生物學知識，其中可溶性線索以一種時空可控的方式呈現(xiàn)給細胞。用于將tdc和iPSCs分化為各種組織類型的可溶性因子列于補充表1。在類器官培養(yǎng)中，這些可溶性線索在體外以生物制劑的形式重現(xiàn)，主要是蛋白質，如生長因子，或小分子藥物，它們可以激活或抑制信號通路。盡管生長因子可能昂貴且不穩(wěn)定，而且許多小分子藥物可能影響多種途徑，導致再現(xiàn)性差，但一些類器官方案結合了生物制劑和小分子藥物的使用。使用來自產(chǎn)生生物活性生長因子(如L-Wnt-3A)的工程細胞系的條件培養(yǎng)基，可以替代常用的生長因子，如WNT3A配體。這些條件培養(yǎng)基面臨類似的批次差異問題，需要嚴格的測試以確保可重復性。因此，新的替代分子開始作為條件培養(yǎng)基的潛在替代品出現(xiàn)。

考慮如何以及何時將可溶性線索添加到類器官培養(yǎng)中是至關重要的，因為體內(nèi)的可溶性線索通常由ECM或附近的細胞呈現(xiàn)給細胞，在時間和空間上是協(xié)調的。這就是時空呈現(xiàn)的概念。例如，現(xiàn)在已知成纖維細胞生長因子(FGF)的活性和特異性可由細胞表面硫酸肝素蛋白聚糖調節(jié)，這表明向細胞培養(yǎng)基中添加游離FGF可能無法重現(xiàn)體內(nèi)組織中FGF的可用性。以時空相關的方式呈現(xiàn)可溶性線索的重要性對于將人類多能干細胞培養(yǎng)成具有多細胞系的復雜結構(如腎類器官)尤為重要。根據(jù)先前的研究83，已知輸尿管上皮由早期遷移的體前中胚層細胞發(fā)育而來。為了概括這一過程，研究了在加入FGF之前初始Wnt信號傳導的不同持續(xù)時間的影響。可溶因子的時空表現(xiàn)可以通過不同的組織工程方法來實現(xiàn)。在一種策略中，這些生長因子可以被封裝在納米顆粒中，并結合到細胞表面以控制釋放。為了模擬某些生長因子是如何在體內(nèi)與ECM結合的，研究人員將聚合物與肝素結合，肝素可以與生長因子結合，或者將這些生長因子與聚合物本身結合。表面捆綁也可以通過納米技術來實現(xiàn)，例如納米壓印光刻、電子束和靜電紡絲，以及帶有納米柱、納米粒子或納米通道的襯底，模擬三維類器官培養(yǎng)的基膜。最后，微流體系統(tǒng)可以用來創(chuàng)建精確控制機械化學性能的微型壁龕。通過定向流動和氣體或小分子的梯度，這些系統(tǒng)可以很好地控制類器官內(nèi)的環(huán)境參數(shù)。在一個例子中，開發(fā)了一種微流體神經(jīng)管裝置，以同時呈現(xiàn)生長因子的相反梯度來指導神經(jīng)管圖案，從而能夠再現(xiàn)體內(nèi)結構。

物理信號

除了生化提示外，考慮何時以及是否有必要為培養(yǎng)的類器官提供適當?shù)奈锢硖崾疽埠苤匾I養(yǎng)物的供應和廢物的清除依賴于擴散，在類器官生長到更大的組織結構時變得不那么有效。這就是為什么腸道類器官需要分裂成更小的細胞簇并定期重新播種的原因。在腦類器官培養(yǎng)中，營養(yǎng)物質和廢物擴散不足也是一個問題，由于無法獲得營養(yǎng)物質，所產(chǎn)生的毫米級結構通常在內(nèi)核內(nèi)表現(xiàn)出壞死。這個問題可以部分地通過搖晃培養(yǎng)、旋轉生物反應器或連續(xù)攪拌下的懸浮液或連續(xù)攪拌生物反應器來解決。這些生物反應器可以監(jiān)測pH值，溫度，氧氣和葡萄糖水平，以最大限度地提高傳質，同時最大限度地減少剪切應力。在這方面，可灌注微流控芯片也被開發(fā)出來，以促進類器官的長期培養(yǎng)。最后，考慮提供地形線索來控制體外類器官培養(yǎng)可能是有用的;已知底物的地形可以調節(jié)細胞面積、形狀和細胞間相互作用，從而產(chǎn)生影響干細胞命運的生化信號。在軟性水凝膠上生長的腸道類器官已經(jīng)證實了地形導向的形態(tài)發(fā)生。

整合線索

與原始的自組織類器官模型相反，上述線索可以被整合以賦予對類器官形態(tài)發(fā)生的更大控制。在組織工程領域，線索整合是一種常用的體外和體內(nèi)組織構建策略。理想情況下，特定的物理或化學線索應該以時空、生理相關的方式，使用簡單、可重復和可靠的方法呈現(xiàn)(補充表2)。我們以腸道類器官為例說明了這一點。在鑒定和分離出居住在隱窩中的LGR+腸道干細胞后，利用生物來源的Matrigel模擬富含層粘連蛋白的隱窩環(huán)境，并在細胞培養(yǎng)基中添加外源性生長因子。大多數(shù)腸道干細胞能夠存活、增殖并形成類器官。然而，由于類器官發(fā)育的隨機性，由此產(chǎn)生的類器官在大小、芽數(shù)和功能上各不相同。在一個如何整合環(huán)境因素(機械和生化)來控制類器官形態(tài)發(fā)生的例子中，將類器官成熟過程分解為不同階段，并使用生物材料工程來確定每個階段的最佳機械-化學環(huán)境。研究表明，隨著時間的推移，可以從高剛度切換到低剛度的機械動態(tài)矩陣可以控制形態(tài)發(fā)生過程。在另一個例子中，人類神經(jīng)管形態(tài)發(fā)生通過微模式模擬，創(chuàng)造了機械化學梯度來調節(jié)細胞-細胞/基質的相互作用，以及可溶性因子的呈現(xiàn)來協(xié)調形態(tài)發(fā)生。

除了這些例子外，其他工程方法也被用于類器官培養(yǎng)來控制細胞的增殖、分化和形態(tài)發(fā)生。生物打印是一種流行的重建組織的生物工程方法。該技術使用生物墨水，包括包裹在生物材料中的活體類器官，以逐層方法精確地創(chuàng)建3D生物幾何形狀，模仿天然組織的幾何形狀。在最近的一個例子中，生物打印被用于生成大型組織結構，人類小腸類器官被用于形成自我進化的組織結構，這是一個被稱為生物打印輔助組織涌現(xiàn)的概念，其中厘米尺度的腸道組織被依次打印以模擬胃腸道的邊界。另一種重建組織的生物工程方法，特別是在不同的組織和器官之間，是使用微流控平臺。微流體系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建包含類器官的微型細胞模型，這些類器官概括了器官生理學的關鍵方面，被稱為器官芯片(OoC)。OoC設備/器件/裝置可以潛在地結合其他生物工程技術來模仿器官和組織的關鍵生理和結構特征。例如，使用合成支架將物理約束設計到類器官環(huán)境中以提供物理邊界。OoC設備還支持共培養(yǎng)或多器官系統(tǒng)。雙器官系統(tǒng)的模擬使用包含不同組織結構的連接腔室來模擬肝損傷(腸上皮細胞和肝細胞)和2型糖尿病(人胰島和肝球體)。最近，一種雙類器官微流控裝置被制造出來，該裝置使用心臟和肝臟類器官進行多次讀出。此外，OoC裝置通過支持生理流速，改善了人類ipsc衍生的胰島、腸、胃和肝臟等器官的特性。腎臟類器官已在OoC裝置中培養(yǎng)，該裝置使流體流動模擬剪切應力并產(chǎn)生血管網(wǎng)絡。

結果

評估培養(yǎng)的類器官是否概括了代表性人體組織或器官的關鍵方面是很重要的。為了實現(xiàn)這一點，這些類器官的表征通常通過評估類器官的細胞組成、結構、功能和表型的穩(wěn)健性來進行。在本節(jié)中，我們通過代表性的例子討論常用的分析方法。

類器官有機物組成和結構

類器官生長是細胞初始聚集、增殖、遷移和分化的過程。在評估類器官是否已經(jīng)成功建立時，關鍵是首先確定類器官是否包含所需的細胞類型，以及類器官在體內(nèi)準確模擬相應組織功能的程度。為了實現(xiàn)這一點，通常進行低通量基因表達驗證和高通量全基因組轉錄組分析。實時熒光定量PCR通常首先作為一種簡單、快速、定量地讀出指示細胞身份的標記基因，包括關鍵轉錄因子和分化標記。Western blotting提供了關于蛋白質豐度、蛋白質降解、蛋白質相互作用和翻譯后修飾的進一步定量信息，這些信息代表了特定細胞類型中特定信號通路的活性。最常用的評估類器官組成的工具是免疫熒光和免疫組織化學成像，使用切片或整片，特異性細胞標記物的抗體染色進一步闡明了各種細胞類型的空間分布和比例。scRNA-seq的高通量分析在全基因組轉錄組水平上描述了類器官中的所有細胞類型-未分化和承諾。然后將這些細胞類型與從相應組織或器官中新分離的細胞進行比較，以評估每個細胞群的相似性程度。考慮到體外培養(yǎng)的類器官含有不同狀態(tài)的未成熟細胞，scRNA-seq可以幫助確定細胞分化狀態(tài)方面的類器官異質性程度。

進行類器官形態(tài)評估，以確定培養(yǎng)的類器官與相應的體內(nèi)組織或器官之間是否存在結構相似性。例如，對于胰島等分泌組織，類器官內(nèi)應存在胰島樣球狀結構，細胞內(nèi)激素囊泡也有望被觀察到。對于分支上皮類器官，如乳腺類器官，期望有明顯的分支結構。對于腸道類器官，應觀察到隱窩樣結構。對于更復雜的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，包括合并的支持細胞，如成纖維細胞和/或內(nèi)皮細胞(ECs)，預計合并的ECs應該形成一個血管網(wǎng)絡，概括類器官周圍的內(nèi)皮-上皮相互作用。

類器官功能

類器官功能的評估包括但不限于成熟細胞的產(chǎn)生、脈管系統(tǒng)或神經(jīng)網(wǎng)絡的形成、對外部刺激的準確反應以及細胞因子或激素的有效分泌等因素。類器官應與新鮮分離的組織作陽性對照。不同的組織需要離散的生理重述，如胃類器官的酸分泌和腸類器官的粘液分泌。表1列出了評估類器官結構和功能的各種表征方法。

            表1 類器官研究中評估/表征類器官結構和功能的方法

胰島類器官

我們以小鼠胰島類器官為例，討論了各種表征和驗證方法(圖3)。通過免疫染色分別檢測相應激素(胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽)的表達，檢測了四種內(nèi)分泌分化細胞類型(β-細胞、α-細胞、δ-細胞和PP細胞)的形成。為了評估β細胞成熟的程度，胰島素分泌顆粒的超微結構形態(tài)分析是通過免疫金透射電子顯微鏡(TEM)成像進行的。為了評估β-細胞對葡萄糖的類器官反應能力，進行了葡萄糖刺激胰島素分泌實驗，例如使用胰島素或c肽ELISA檢測，循環(huán)高糖和低糖孵育。由于胰島素釋放與鈣動態(tài)相關，鈣信號示蹤成像對葡萄糖的反應迅速增加并返回基線。為了測試移植后胰島類器官的全部潛力，需要進行體內(nèi)功能評估，以改善鏈脲佐菌素誘導的1型糖尿病小鼠模型的高血糖表型。表征參數(shù)包括正常且穩(wěn)定的血糖水平、正常的血漿胰島素水平和維持的體重。

                      圖3: 胰島類器官驗證分析的代表性結果

A，培養(yǎng)第7天胰島類器官的代表性圖像。在矩陣中生長的類器官呈球形。高倍鏡下，這些球形類器官被內(nèi)皮細胞(ECs)包圍(箭頭)。類器官通過疾病從母體釋放后的景象。B，通過免疫熒光或免疫組織化學染色驗證細胞類型和激素分泌水平。胰島素(Ins);β-細胞)，胰高血糖素(Gcg;α-細胞)，生長抑素(Sst;δ-cells)和胰多肽(Ppy;在成熟的類器官中可以檢測到PP細胞(由DAPI顯示;藍色)。標尺，20 μm。C，經(jīng)過長時間培養(yǎng)共30天誘導的成熟類器官的形態(tài):類器官被精心設計的EC網(wǎng)絡(Ca和Cb部分)所包圍，由Cd31(內(nèi)皮標記物)顯示;紅色)和DAPI(類器官核;藍色)染色(Cc部分)。標尺，50 μm。D，部分關鍵轉錄因子和分化標記的實時熒光定量PCR分析。E，體外胰島類器官功能驗證。類器官依次用低(2 mM)和高(20 mM)濃度葡萄糖孵育三輪，然后進行c肽ELISA和鈣成像。F，類器官分泌c肽測定的代表性ELISA結果。培養(yǎng)基中c肽濃度的升高是對高糖刺激的急劇反應。** p < 0.01;*** p < 0.001。G，鈣信號示蹤成像強度的代表性曲線，表明類器官對葡萄糖的急性反應能力，高/低鈣活性與高/低葡萄糖刺激一致。氯化鉀孵育作為陽性對照。H，體內(nèi)胰島類器官功能驗證。將類器官(或作為陽性對照的新鮮胰島)移植到鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的腎囊中，監(jiān)測某些生理指標，表明糖尿病表型得到了挽救。最后，將移植物移除，預計小鼠的血糖水平會飆升，進一步證明移植物是降低血糖水平的原因。

腸道類器官

腸道類器官是最早在體外成功建立的類器官類型之一。經(jīng)典的隱窩絨毛樣結構被認為是成功建立類器官的重要特征，具有適當?shù)姆种螒B(tài)，具有強大的多細胞組成和位置，反映了類器官的分化和成熟水平。Lgr5標記物的表達可以通過實時定量PCR或Lgr5熒光報告儀成像分析腸道干細胞的維持情況。通過標記物的染色來評估分化的細胞，包括溶菌酶(用于Paneth細胞)、絨毛蛋白(用于腸細胞)、粘蛋白2(用于杯狀細胞)和嗜鉻粒蛋白A(用于腸內(nèi)分泌細胞)。這些不同的細胞類型也可以通過透射電鏡根據(jù)它們特有的亞細胞結構來區(qū)分。由于成熟的杯狀細胞分泌粘液，功能性腸道類器官表現(xiàn)出相對較厚的黏液層，可通過阿利新藍和周期性酸-希夫染色檢測。

肝臟類器官

在肝臟的情況下，已經(jīng)從小鼠和人類組織樣本中建立了膽管細胞和肝細胞類器官。通過測量類器官細胞的傳代時間和增殖來評估肝類器官。在標志物表達方面，從RNA水平(實時定量PCR、scRNA-seq)和蛋白質水平(免疫熒光染色)兩方面評估特異性膽管細胞(如KRT19、KRT7、SOX9)或肝細胞(如ALB、HNF4A、MRP4)標志物。通常，肝祖細胞的標志物(如LGR5)也被用來評估培養(yǎng)細胞的分化狀態(tài)。為了評估類器官功能，進一步在RNA水平上分析肝細胞的CYP3A4和CYP3A11等標志物。此外，白蛋白分泌、低密度脂蛋白攝取、定期酸希夫染色評估糖原積累的存在、膽汁酸產(chǎn)生和肝酶(如CYP3A4)的活性使用化學測定來確認肝細胞功能。類器官的超微結構也經(jīng)常通過透射電鏡評估典型的肝細胞或膽管細胞形態(tài)。最后，為了最終測試功能，類器官通常被移植到FRG免疫缺陷小鼠中，以觀察移植物在體內(nèi)的整合和功能。

腫瘤類器官的驗證

患者來源的腫瘤類器官必須保持起源組織的基因組、轉錄組學、形態(tài)學和功能特征。因此，在組織學和免疫組化譜、轉錄組學和基因組學方面，通過與來源于它們的組織進行比較來驗證它們是很重要的。腫瘤類器官的細胞組織、組織結構和蛋白質表達模式可以很容易地與原發(fā)癌進行比較。類似地，類器官的基因表達譜與它們賴以形成的腫瘤相似。這已經(jīng)通過RNA-seq在許多類型的腫瘤上得到證實，包括膀胱癌和食管癌等等。最后，確認腫瘤類器官是否在基因組水平上偏離患者腫瘤是很重要的。一些研究表明，在突變和拷貝數(shù)變異方面，類器官和親本組織是一致的。更大程度的差異可能歸因于腫瘤內(nèi)部的空間異質性和抽樣偏差:腫瘤可能具有空間多樣性，而從特定部分產(chǎn)生的類器官可能缺乏遙遠地區(qū)的代表性。除了這個地形問題，培養(yǎng)條件可以幫助選擇特定的克隆，可能隨著時間的推移改變或減少克隆性。

當長時間培養(yǎng)時，腫瘤類器官的驗證更為關鍵。雖然一些研究報道分子特征可以在長期培養(yǎng)中保持，但其他研究則觀察到連續(xù)傳代后腫瘤的進化。例如，肝癌類器官的外顯子組測序顯示，突變一致性從培養(yǎng)少于2個月的類器官的92%下降到培養(yǎng)超過4個月的80% 。從微衛(wèi)星不穩(wěn)定腫瘤中建立的結直腸腫瘤類器官在長期培養(yǎng)后比穩(wěn)定腫瘤有更高的新生突變。觀察到的一些差異可能歸因于不同的無性系和亞無性系如何在培養(yǎng)中適應和擴展。通過對500個癌癥相關基因進行深度靶向測序，研究人員發(fā)現(xiàn)保留了截斷突變，而獲得或丟失了亞克隆突變，每個通道都發(fā)生了突變126。大多數(shù)突變和拷貝數(shù)變異在肺癌類器官傳代后期得以保留，而新生突變可歸因于原腫瘤中存在的一小部分細胞的亞克隆擴增。總的來說，這些研究表明遺傳漂變可能發(fā)生在長時間培養(yǎng)的類器官中，影響其作為功能和藥物發(fā)現(xiàn)研究模型的可靠性。這重申了在腫瘤類器官建立、表征和測試的背景下驗證的重要性。作為分析的一個例子，展示了肝癌類器官表征的關鍵步驟(圖4)。最后，正常組織污染是建立腫瘤類器官的一個問題，在驗證患者來源的模型時應予以解決。正常細胞的存在可以通過組織學比較和免疫組織化學以及測序來估計。

                      圖4: 腫瘤類器官的典型特征:肝癌亞型

a，從患者樣本和類器官培養(yǎng)中分離細胞，并附有組織分離和處理示意圖。b，肝癌樣本的組織學分析。上行為組織(比例尺:50 μm)，中行為類器官亮場圖像(比例尺:100 μm)，下兩行為類器官的組織學血紅素和伊紅(H&E)染色(比例尺:50 μm)。c、特異性標記基因表達分析，包括AFP(肝細胞/肝細胞癌)標記物的免疫熒光染色;紅色)和EpCAM(導管/膽管癌(CC)標志物;綠色)。DAPI染色為藍色。比例尺:30μm。d, Organoid傳代為生長和分裂曲線，其中圓點表示分裂時間點，箭頭表示持續(xù)擴張。e，異種移植物移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)。異種移植和組織病理學分析，與患者原始組織樣本相匹配。比例尺尺寸:125 μm，插入尺寸:62.5 μm。f，分析癌癥類器官的遺傳變化及其與原始腫瘤樣本中突變的一致性。g，吉西他濱治療的半最大抑制濃度(IC50)曲線顯示對藥物的類器官敏感性。CHC, HCC/CC合并腫瘤;原發(fā)性肝癌PLC;SC,皮下。

數(shù)據(jù)分析
圖像處理與分析

圖像處理采用ImageJ/Fiji134、CellProfiler等軟件。在一定時期內(nèi)形成的類器官的數(shù)量、類器官的大小(以面積或體積衡量)和細胞數(shù)量可以衡量細胞的增殖速度。使用可用的軟件插件，可以通過edu陽性或ki67陽性細胞核的比例來定量細胞增殖。考慮到功能成熟度，在量化成功率時，形態(tài)學評估(如腸類器官系統(tǒng)的芽形成率)也是必要的。可以記錄不同組織類型成熟標記物的平均和/或歸一化熒光強度，以測量類器官的成熟水平。長期的實時成像可以使用軟件來跟蹤細胞行為，以進行譜系追蹤。利用網(wǎng)絡資源對多組學數(shù)據(jù)進行通路分析和可視化，生成熱圖，以了解organoid的分化階段。其他軟件，如Profiler、GSEA、Cytoscape和enrichment map，已被用于生物分子相互作用網(wǎng)絡、途徑富集分析和可視化。

表型的數(shù)據(jù)分析分類

使用機器學習和基于人工智能的數(shù)據(jù)分析的小型化和自動化使類器官的高通量和多維表型更加一致。近年來開發(fā)了各種用于這些目的的軟件，包括ilastik, OrganoidTracer和Phindr3D。其中大多數(shù)都有斐濟或CellProfiler插件，這使得沒有大量計算專業(yè)知識的用戶可以在更短的時間內(nèi)處理大型數(shù)據(jù)集。這些軟件通常包含圖像分割、對象分類、形態(tài)表征、熒光強度定量、細胞計數(shù)和數(shù)百張圖像跟蹤等功能。良好的圖像質量是魯棒性結果的先決條件，因此優(yōu)化圖像采集過程至關重要。在數(shù)據(jù)處理的不同階段，建議驗證訓練算法的準確性。

應用

類器官作為一種以細胞為基礎的工程模型，可以概括相關的生理結構和功能，在基礎研究和臨床應用中都顯示出巨大的潛力。在這里，我們總結幾個應用。

組織再生

組織來源的類器官可能是再生醫(yī)學可移植材料的潛在來源。小鼠的腸道、肝臟和胰腺類器官已成功移植到小鼠體內(nèi)，并恢復了器官功能。例如，肝類器官已經(jīng)從小鼠肝臟分離的肝細胞中產(chǎn)生。這些類器官被注射到富馬酰乙酸水解酶(Fah)缺乏的小鼠體內(nèi)，這種缺陷會導致肝損傷，在用保護肝的尼替西酮(nitisinone)藥物治療后存活時間短(40天)。類器官移植率高達80%，移植小鼠在尼替西酮治療中斷后存活時間超過100天。同樣，在人工ECM中培養(yǎng)的胰島可以成功地移植到鏈脲佐菌素誘導的或自身免疫驅動的糖尿病小鼠模型中，挽救胰島素的產(chǎn)生并逆轉高血糖。除了小鼠類器官外，從肝臟樣本中提取的EpCAM+導管細胞衍生的人類肝臟類器官已被移植到急性肝損傷的免疫缺陷小鼠中。人類胰腺類器官可以由ALDHhigh干細胞產(chǎn)生，并且具有產(chǎn)生胰島素的潛力，但尚未有體內(nèi)證據(jù)證實其移植。腸道類器官已被證明融合成類似體內(nèi)腸道的管狀結構。更復雜的腸道類器官也可以在具有可調節(jié)生物降解性的人工ECM中生成。盡管將類器官用于再生醫(yī)學還有很長的路要走，但是已經(jīng)建立了生成正常組織類器官的改進方案、確保高可重復性、移植和功能的良好制造規(guī)范。

藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)研究

近年來，快速和高通量3D類器官篩選的技術挑戰(zhàn)已經(jīng)得到解決，并通過不同的手段超越，包括替代板設計或播種幾何形狀。對來自卵巢或腹膜腫瘤患者的類器官的240種酪氨酸激酶抑制劑進行篩選，在手術后一周內(nèi)提供個體化藥物敏感性資料。該研究包括一種卵巢癌肉瘤，這是一種散發(fā)性卵巢癌，目前尚無一線治療方法。腫瘤類器官可以通過篩選從結構相似的候選藥物中選擇有效藥物，并研究不同藥物聯(lián)合治療的協(xié)同效應。活檢樣本或手術切除樣本中鄰近正常組織的非腫瘤細胞可用于培養(yǎng)對照健康類器官，以確認所測試藥物的腫瘤特異性功效。類器官可以用免疫細胞文庫篩選，這些免疫細胞經(jīng)過工程改造，表達針對不同新抗原的嵌合抗原受體。檢查點抑制劑和其他免疫腫瘤藥物也可以在包括免疫細胞在內(nèi)的腫瘤類器官模型中篩選。

生物標志物的研究

由于類器官可以維持親本組織的基因組圖譜，藥物篩選可用于提供基因突變和藥物反應之間的聯(lián)系。通過對7名患者的胃癌類器官進行37種藥物的篩選，ARID1A突變的腫瘤被證明對ATR抑制劑敏感，這支持了先前的研究，并在功能上確定了對一類被認為不可藥物的突變的干預措施。

精準醫(yī)療應用

人們對為每位患者量身定制癌癥治療越來越感興趣。精準醫(yī)學常常是基因組學的同義詞。然而，正如幾項臨床試驗所顯示的那樣，只有一小部分患者具有可操作的改變，可以結合特定的干預措施。在評估大規(guī)模實施測序驅動療法的NCI-MATCH試驗中，只有大約37%的患者被發(fā)現(xiàn)具有可操作的突變。這項和其他精準醫(yī)學試驗表明，許多有針對性的干預措施的臨床效益有限，反應率適中，揭示了很大程度的復雜性。例如，SHIVA試驗比較了基因組引導干預與腫瘤學家選擇的常規(guī)治療方法對大量預處理的癌癥患者的結果，結果顯示無進展生存沒有差異。盡管基于基因組學的精準醫(yī)學干預的臨床療效存在爭議，但很明顯，大多數(shù)癌癥患者沒有可靶向的基因來指導治療。功能精準醫(yī)學——基于測試患者腫瘤的藥物反應來確定治療方案——已經(jīng)被提議作為一種更直接的替代方案，因為它不需要任何關于腫瘤分子特征或其他特征的先驗知識。類器官是功能精準醫(yī)學的理想選擇，因為它們易于建立，與原始組織高度相似，易于處理，并已被用于識別許多腫瘤的治療先導，包括那些往往在分子水平上研究不足和特征不佳的罕見癌癥。最近，從患者來源的異種移植物中建立的類器官被用于鑒定伊瑞布林對復發(fā)性三陰性乳腺癌患者的治療。患者的無進展生存期在伊瑞布林治療方案中比之前的治療方案長3.5倍，表明類器官在臨床護理中的潛力。

異種移植物的來源材料

類器官越來越多地被用作種子材料，以產(chǎn)生具有著陸率的異種移植物。這個過程包括使用完整的類器官或消化后的單個細胞。將攜帶APC、SMAD4、TP53、KRAS和/或PIK3CA突變的CRISPR-Cas9轉化的人腸道類器官植入免疫功能低下小鼠的包膜下腎間隙。攜帶一個或兩個基因突變的良性類器官不能形成腫瘤，而攜帶四個或五個基因突變的類器官具有致瘤性。

患者來源的類器官也可以產(chǎn)生異種移植物，證實其致瘤能力，并概括親代腫瘤的組織學。在一項結腸直腸癌的研究中，良性腫瘤類器官在小鼠體內(nèi)沒有或只有很小的植入。相比之下，來自轉移的結直腸癌類器官比來自原發(fā)腫瘤的類器官更具侵襲性。由膠質母細胞瘤多形性細胞形成的異種移植物的形態(tài)比較，無論是作為腫瘤球體還是作為類器官，腫瘤球體的細胞表現(xiàn)為固體生長模式，而類器官更具有彌漫性，類似于原始腫瘤。來源于膀胱管腔腫瘤的類器官系移植到小鼠體內(nèi)后，可產(chǎn)生具有相同管腔表型的腫瘤。

傳染病

類器官模型已廣泛應用于宿主-病原體相互作用的研究。例如，從組織和器官中提取的類器官，如腸、肝、肺、口腔黏膜和胃，已與細菌、病毒和寄生蟲等病原體共同培養(yǎng)。在人類腸道類器官中，分化的腸細胞比未分化的腸細胞更容易感染人輪狀病毒(HRV)。感染HRV或輪狀病毒腸毒素的類器官表現(xiàn)出腸腔腫脹，這是輪狀病毒引起的腹瀉的一個特征。以人肝類器官為藥物篩選平臺，檢測抗HRV藥物和抗體，鑒定出能夠阻斷輪狀病毒體外復制的霉酚酸、IFNγ和抗輪狀病毒VP7抗體。類器官也可用于致癌病原體的研究。幽門螺桿菌感染小鼠胃類器官時，細菌源性CagA誘導的胞漿β-catenin水平升高，導致感染的類器官增殖增加。

自COVID-19大流行開始以來，幾個實驗室研究了SARS-CoV-2病毒對類器官的影響。用表達ace2的管腔細胞生成了可感染sars - cov -2的遠端肺類器官。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2的目標是杯狀細胞，而不是纖毛蟲細胞，這與之前在二維空氣-液體界面模型中的研究形成了對比。對腸道類器官的研究表明，SARS-CoV-2也可以感染腸細胞，CRISPR-Cas9和藥物篩選表明，敲除TMPRSS2或TMPRSS4，或用卡莫司他治療，都可以減少病毒感染。

常見病和罕見病生物學

類器官在模擬和研究由各種不同器官引起的常見和罕見疾病方面已顯示出重要的效用。囊性纖維化是一種由CFTR基因突變引起的遺傳性疾病，CFTR基因表達一種跨膜氯化物和碳酸氫鹽轉運體。據(jù)報道，有超過2000個與囊性纖維化相關的CFTR突變，但臨床上部署的小分子治療僅針對其中的一個子集。CFTR突變可引起多器官功能障礙，影響肺、胰腺、肝臟和腸道。結腸、肝臟和膽管、直腸、呼吸系統(tǒng)和小腸的囊性纖維化類器官模型已經(jīng)從小鼠模型或患者的相關器官的成體干細胞中獲得，其應用范圍從研究疾病生物學到反映患者的藥物反應。Forskolin是一種CFTR激活劑，已被用于誘導由于氯化物和流體流入管腔而引起的類器官腫脹，患者來源的直腸類器官腫脹減少與患者的臨床反應參數(shù)相關，這可以模擬對特定治療方案的個性化臨床反應。囊性纖維化類器官也被用于研究基因治療干預措施，并能夠利用CRISPR-Cas9挽救CFTR突變在腸道類器官中的作用。

炎癥性腸病，如潰瘍性結腸炎和克羅恩病也用類器官模型進行了研究。炎癥性腸病患者的腸道上皮細胞衍生的類器官具有炎癥性腸病特異性的DNA甲基化特征，盡管保持相似的形態(tài)。生成肝臟類器官來模擬肝臟疾病，如α - 1抗胰蛋白酶缺乏癥、Alagille綜合征35和原發(fā)性硬化性膽管炎。已經(jīng)建立了肺類器官來研究杯狀細胞化生等疾病。

再現(xiàn)性和數(shù)據(jù)積累
異質性和可重復性

類器官在形成類器官的細胞之間(類器官內(nèi)異質性)、同一培養(yǎng)皿中的類器官之間以及個體患者之間(類器官間異質性)表現(xiàn)出異質性和可變性。這種異質性對于概括個體之間的差異是有價值的，特別是在人類疾病的背景下，并且在癌癥研究中對于模擬個性化醫(yī)療的患者特異性癌癥發(fā)展是有價值的。類似地，類器官內(nèi)變異反映了組織細胞組成的復雜性。這有利于模擬組織發(fā)育或再生，細胞形成包含不同細胞狀態(tài)的類器官，從干細胞/祖細胞到更分化的細胞。盡管這些水平的變異和異質性反映了生物系統(tǒng)的復雜性，但如果不加以控制，它們可能會危及系統(tǒng)的可重復性和穩(wěn)健性。

形態(tài)和功能甚至類器官形成效率的顯著差異取決于培養(yǎng)物的不同來源細胞或類器官中的不同細胞，以及不同的培養(yǎng)基組成。關于細胞來源，用于產(chǎn)生起始培養(yǎng)的iPSCs/多能干細胞的批次和質量會影響所獲得的類器官系的變異性。同樣，從不同動物或病人身上分離出的不同原代細胞也會影響隨后的培養(yǎng)。培養(yǎng)基通常是為細胞增殖而優(yōu)化的，而向某些細胞命運的分化在很大程度上受培養(yǎng)條件的影響，從而增加了變異性和異質性。培養(yǎng)條件的改善已被證明可以增加人小腸類器官中分化細胞命運的多樣性。未定義的ECM(如Matrigel)具有未知的成分和批次間的可變性，使再現(xiàn)性成為一個重要問題。在研究類器官發(fā)育過程中的轉錄組變化或研究類器官傳代過程中的基因表達變化時，另一個重要因素變得顯而易見。當類器官模擬發(fā)育時，這些變化可能導致混淆效應，例如，時間異質性。因此，在文化中記錄通道和時間對于確定影響結果的變異來源至關重要。

為了更好地理解和控制異質性，該領域已經(jīng)從大量分析轉向使用單細胞方法，如scRNA-seq，以幫助描述不同的類器官形成細胞群。許多單細胞分辨率的數(shù)據(jù)集正在出現(xiàn)，其中有幾個值得注意的例子是更均勻的類器官生產(chǎn)和在生長過程中解決類器官異質性。匯集不同的細胞和/或類器官進行批量分析可能導致不準確的結果。因此，對實驗中收集到的數(shù)據(jù)進行良好的記錄對于得出可靠的結論至關重要。

此外，隨著油田復雜性的增加，減少可變性和異質性的來源是至關重要的。努力產(chǎn)生包含不同細胞群的更完整的類器官結構——例如最近發(fā)表的內(nèi)皮和健康的人類結腸癌和人類結直腸癌類器官，小鼠膽管細胞和間充質類器官，以及小鼠胰島和內(nèi)皮類器官——將需要控制變異來源，這些變異來源于將額外的細胞納入已經(jīng)異質的系統(tǒng)。在產(chǎn)生更多功能相關結構的同時對變異進行控制是該領域面臨的重大挑戰(zhàn)。

最后，在類器官治療后也觀察到顯著的異質性。雖然這在試圖使用類器官作為研究分子機制的工具時是一個缺點，但在旨在模擬患者反應時是有益的。特別是，對于癌癥治療，幾種不同的患者來源的類器官模型(包括但不限于胰腺、結直腸癌和肝癌)對已知的化療和抗癌藥物表現(xiàn)出異質反應。這與臨床觀察到的患者結果的可變性相似，并將癌癥類器官定位為藥物測試的潛在預測工具。這種治療反應的異質性目前正被用于治療囊性纖維化患者，由hit -囊性纖維化聯(lián)盟領導的一項大型歐洲多中心臨床試驗正在進行中，以確定潛在的應答者。類似的舉措對癌癥患者來說是滯后的，盡管主要是因為建立率的差異和漫長的時間表。類器官最近被用于治療一種罕見的肝癌患者，但不幸的是，由于患者的一般情況惡化，治療停止，使作者無法得出關于類器官系統(tǒng)對藥物治療的預測價值的結論。

最低報告標準

為了提高結果的可重復性和可靠性，必須考慮不同細胞分離和類器官內(nèi)異質性之間的可變性。雖然人們可以認為至少三個獨立的實驗，至少三個不同的生物復制是最低要求，但這可能并不總是足夠的。事實上，每個生物重復研究的類器官數(shù)量以及生物重復的數(shù)量取決于研究問題、具體實驗和觀察到的表型的可變性。在可能的情況下，強烈建議計算每個生物重復的獨立類器官的數(shù)量，類似于用于小鼠實驗的樣本量計算，并考慮到實驗的統(tǒng)計能力和方差。數(shù)據(jù)應該是穩(wěn)健的，這意味著在至少三個獨立的生物重復中重復，這是指從不同的動物或患者中獨立分離。但應提前確定每個實驗的重復和研究問題，避免撈假設和增加重復，以獲得條件之間的顯著性。數(shù)據(jù)應正確地報告為每個重復的平均值，每個重復是相似數(shù)量的類器官的平均值。最近，一些出版物提供了提高可重復性的指導方針，包括一般的生物報告和準確的統(tǒng)計。SuperPlots推薦用于數(shù)據(jù)可視化，因為它既顯示了每個獨立生物復制的平均值，也顯示了單個數(shù)據(jù)點的分布。這種類型的圖是理想的類器官報告，因為它可以立即可視化有關批次變化的任何潛在人工制品。期刊收藏加深了生物科學中使用的統(tǒng)計學的各個方面，是促進準確報告的寶貴資源。

類器官應充分表征，不僅要檢查標記物的表達，還要以起源組織為基準。至關重要的是，不僅要確定細胞是否具有與起源組織相似的形態(tài)和表達模式，而且要確定它們具有相似的功能(例如，使用ELISA檢測肝臟/肝細胞類器官產(chǎn)生的白蛋白、膽汁酸)。只要有可能，比較條件之間的結果應根據(jù)DNA含量(用于基因組分析)或結構蛋白(如肌動蛋白，用于western blotting)進行歸一化，而來自ELISA的功能數(shù)據(jù)應歸一化為每個孔中被比較的細胞總數(shù)或類器官結構面積。改進報告標準是提高可重復性的第一步，從而使該領域能夠向前發(fā)展。

數(shù)據(jù)積累

標準化的類器官數(shù)據(jù)庫目前尚不存在。一個值得注意的例外是由美國國家癌癥研究所(NCI)和人類癌癥模型倡議(HCMI)領導的患者衍生的癌癥類器官庫。然而，健康的患者來源的類器官和非癌癥疾病的類器官模型，包括人類和小鼠，尚未在一個數(shù)據(jù)庫中記錄，這表明顯然需要完整地記錄、報告和保存所產(chǎn)生的所有類器官系。最近啟動的人類細胞圖譜-類器官計劃(Human Cell Atlas-Organoid initiative)記錄了所有源自人類的類器官，是朝著這個方向邁出的第一步。對于轉錄組學相關的數(shù)據(jù)，如基因表達、非編碼RNA、ChIP、基因組甲基化、高通量PCR逆轉錄、SNP陣列、SAGE和蛋白質陣列，通常推薦使用gene expression Omnibus (GEO) 。對于用于分析類器官數(shù)據(jù)集的代碼，建議使用GitHub。我們設想，數(shù)據(jù)和類器官庫將很快出現(xiàn)，以填補目前在類器官工作數(shù)據(jù)存儲庫中缺失的空白。當存儲來自人類類器官的數(shù)據(jù)時，重要的是要考慮所有倫理法規(guī)以及獲得患者同意和保持患者匿名的必要性。其他地方已對臨界點進行了廣泛審查。

在類器官命名法上也缺乏共識。除了一些值得注意的例子，如腸、肝和胰腺的領導者對腸道、肝臟、胰腺和膽道類器官的命名進行了討論外，該領域正在等待一個更明確定義的命名系統(tǒng)。

限制和優(yōu)化

獲得的三維類器官系統(tǒng)在形態(tài)和功能上的可重復性仍然是一個主要的瓶頸。在本節(jié)中，我們詳細闡述了類器官研究的局限性和最新進展，為開發(fā)、表征和基準化類器官系統(tǒng)提供了一條更優(yōu)化的途徑。

有限的成熟度和功能

目前的類器官模型系統(tǒng)沒有一個能再現(xiàn)其各自器官的細胞類型、成熟水平和/或功能的完整生理庫;相反，它們表現(xiàn)出它們主要形成的組織的某些功能。絕大多數(shù)組織源性類器官模型缺少組織特異性細胞類型，包括小生境特異性間充質、免疫細胞、血管化、神經(jīng)支配或微生物組。最近，導管細胞-肝間充質細胞共培養(yǎng)已被證明再現(xiàn)了部分肝門靜脈結構。特別具有挑戰(zhàn)性的是，并非所有細胞類型都具有相同的增殖速率，生長因子需求甚至氧暴露需求(血管缺氧)。多能干細胞衍生的類器官能更好地概括不同類型的細胞和發(fā)育器官的細胞相互作用，但不能表現(xiàn)成體組織的結構和功能，以及細胞成熟。一種有效的策略是體內(nèi)移植。然而，這是以放棄對形成的組織結構的控制為代價的。同時，對分化協(xié)議進行優(yōu)化，以豐富成熟和感興趣的特定功能。

另一個導致成熟和功能受限的因素是營養(yǎng)物質的可及性和死細胞在空心管內(nèi)的積累。這對于iPSC衍生的類器官尤其重要。隨著類器官的增大，位于類器官中心的細胞的營養(yǎng)供應受到限制，導致細胞死亡。這在結構更緊湊的類器官中很常見，比如大腦類器官。對于形成中空囊腫的組織源性類器官(膽管細胞，胰腺)，死細胞最終將開始在其腔內(nèi)積聚，這是不可避免的，但可以通過類器官的機械破碎來解決。已形成結構的不斷破碎阻礙了長期研究的開展。然而，多能干細胞衍生的類器官不能破碎和傳代;解決營養(yǎng)可及性問題的新策略正在開發(fā)中，包括在體外長期維持腦切片。

異質性的有限控制

一旦細胞形成類器官，我們對類器官內(nèi)細胞行為的輸入就會減少。即使在相同的實驗環(huán)境中，結果往往是過多的表型特征(形狀，大小，細胞組成)，而不是刻板的培養(yǎng)。優(yōu)化形態(tài)發(fā)生梯度、組織特異性細胞- ECM相互作用以及局部生化和生物物理特性對于減少批間異質性至關重要。

為了產(chǎn)生更復雜的多細胞成熟和功能結構，類器官領域已經(jīng)開始創(chuàng)造組裝體，如人類皮質-運動組裝體。這樣的努力可以創(chuàng)造出更復雜的結構，用一個明確的界面連接多種類型的組織，比如用神經(jīng)-肌肉連接連接大腦皮層、脊柱和骨骼肌，但代價是可重復性。正如最近另一篇關于肝臟、膽道和胰腺類器官的綜述所討論的那樣，多細胞和多組織類器官系統(tǒng)的可重復性降低，因為協(xié)調多種細胞類型的增殖和分化具有挑戰(zhàn)性。

對類器官內(nèi)異質性的有限控制不利于高通量篩選應用，并使需要高時空分辨率成像的研究變得困難。與其創(chuàng)造更復雜的類器官系統(tǒng)，不如用更簡單的降維模型來概括重要的組織結構和功能。ECM組合的變體，微圖案的2D單培養(yǎng)或共培養(yǎng)，細胞片，堆疊的3D結構25和微定位的ECM基板允許形成具有高度時空控制的可復制組織結構和功能，如拉伸和滲透力(圖5)。

                         圖5: 通過降低復雜性來降低異質性

a - c，類器官發(fā)育過程包括初始2D條件的形成(a部分)，生長成3D結構(b部分)和組織形態(tài)發(fā)生(c部分)。d,e，簡化的模型來概括基本的組織結構和感興趣的功能正在獲得動力。微圖案2D單培養(yǎng)或共培養(yǎng)允許形成可復制的初始2D條件，該條件可進一步形成初始3D結構。例如，隱窩的形成可以通過局部基質軟化來控制，幾何結構可以誘導中心區(qū)域的腸細胞(L-FABP染色)和芽區(qū)增殖的LGR5細胞的模式分化(d部分)。隨后，高度的時空控制可以應用于指導某些組織形態(tài)發(fā)生。例如，神經(jīng)細胞分化模式可通過拉伸幅度和時間調節(jié)242。圖表示從0到100%的拉伸幅度，散點(S)和圖案(P)是分化圖案的兩種構型。f、滲透力可以控制腸道類器官的隱窩形態(tài)243。比例尺:30 μm (d部分)、50 μm (e、f部分)。Blebb blebbistatin;hNTO，人神經(jīng)管類器官;PGE，前列腺素E2。

優(yōu)化ECM成分

已經(jīng)實施了工程方法來優(yōu)化這些限制(圖6)。克服使用非特異性ECM(如Matrigel)的主要途徑有兩種:一種是使用對成分和剛度具有更完全控制的合成基質，另一種是采用脫細胞組織并創(chuàng)建組織特異性基質。鑒別化學定義的、與GMP兼容的ECM，使人類類器官的生長和長期擴張取得了重大進展。在這方面，人類胰腺類器官、腸道類器官和結腸直腸癌類器官取得了一些進展，這些器官可以在基于葡聚糖的完全定義的ECM中生長;然而，它們不會長期擴張。

    圖6: 目前類器官培養(yǎng)的局限性和克服這些局限性的方法的并排比較

a，囊性類器官腔內(nèi)死細胞和細胞碎片的積累(左)已經(jīng)通過設計可灌注的開放式結構(右)來克服，該結構使用誘導流來沖洗細胞碎片，這與長期實驗更相容。b，在Matrigel穹頂中生長的類器官顯示出細胞異質性和形態(tài)的高度可變性(左)，這可以通過使用具有圖案合成細胞外基質(ECM)的網(wǎng)格(右)來克服，該網(wǎng)格為細胞分化提供線索。這些平臺還與高通量篩選兼容。c，單細胞類型衍生的類器官不能概括天然組織的細胞和生理復雜性(左圖)，但將類器官與器官芯片(OoC)結合(右圖)作為一種新技術，將能夠創(chuàng)建適合多種細胞類型的受控微環(huán)境。

類器官與器官芯片相遇

研究表明，通過在灌注可溶性微環(huán)境中最大化傳質和最小化剪切應力，在OoC環(huán)境中生長的細胞上調了它們的功能，更接近天然組織。最近的一個例子表明，液體流動的存在如何促進體外腎類器官的成熟并促進其血管化。通過在相同大小的隱窩中自組織的工程支架，將物理約束設計到類器官環(huán)境和腸細胞中。同時，他們克服了囊性類器官的不可接近性和細胞碎片的清除，創(chuàng)造了一種可灌注培養(yǎng)的小腸，其中細胞排列形成管狀上皮和與體內(nèi)組織相似的空間排列。

前景

展望未來，趨勢是開發(fā)更復雜的模型，盡可能忠實地概括體內(nèi)的結構和功能，根據(jù)概括細胞類型隨時間的變化，組織結構，可測量的分子事件和表型功能。與其只關注最突出的標記或功能分析，還應該對原生組織進行架構基準測試。在肝細胞類器官的例子中，肝細胞的功能得以保留，但肝組織結構與肝細胞排列成索狀的天然組織不匹配。類似地，類器官如胰腺癌或結腸癌的類器官也呈各向同性生長，形成囊腫，而不是它們在原生組織中形成的管狀結構。為了獲得更復雜的功能，具有多細胞和多組織結構的類器官將是重要的，特別是在研究細胞-細胞相互作用的背景下。沿著這條脈絡，組裝體和芯片上的器官也變得越來越復雜，被越來越廣泛地采用。

另一方面，工程師的方法是追求由驅動感興趣的復雜細胞或組織功能的最小功能模塊定義的更簡單的還原論模型，研究發(fā)育或修復中的機械生物學因果關系，或開發(fā)用于高通量篩選的強大系統(tǒng)。基本前提是，復雜的生物功能是通過有限數(shù)量的功能模塊的協(xié)調操作來執(zhí)行的，每個功能模塊由一小組分子描述，化學反應驅動中尺度(亞細胞或細胞間組織/多細胞)結構與特定時空階段/階段/步驟中感興趣的功能相關的物理屬性變化。例如，肝臟中的膽管表現(xiàn)出每小時擴張和收縮的周期。為了高分辨率地研究引起性收縮事件，僅在鄰近肝細胞整個調節(jié)機制的背景下直接研究形成膽管的鄰近肝細胞區(qū)域。人們可以選擇創(chuàng)建一個包含膽管細胞的更大的結構，而不是由最小功能模塊操作的結構，但該模型將是嘈雜和昂貴的。每個功能模塊都耦合到另一個模塊，可以一起建模，也可以在不同的長度尺度上獨立建模。簡單的還原論模型對于組織形態(tài)發(fā)生事件如缺陷的高分辨率機制理解是有用的。

從幾何上限制初始2D播種模式和3D形成的大小，并使用Matrigel支持3D細胞生長，可以誘導組織樣神經(jīng)管形態(tài)發(fā)生并生產(chǎn)高度可復制的神經(jīng)管。這也允許識別神經(jīng)管折疊的機制和模擬神經(jīng)管缺陷。在另一個例子中，細胞均勻球體的對稱性破壞和Paneth細胞的出現(xiàn)是腸道類器官形成早期的關鍵事件。其機制最近被闡明:對稱破缺是由機械傳感器YAP1的瞬時激活引起的，YAP1誘導NOTCH-DLL1側向抑制事件。YAP1的激活已經(jīng)通過在水凝膠支架中施加幾何約束來控制，并產(chǎn)生均勻且可復制的腸道微組織。

類器官可以通過減少2.5D培養(yǎng)中的第三維來限制。2.5D培養(yǎng)降低了典型類器官的深度驅動變異:低氧核心的擴散限制，藥物/轉染劑的可及性受限以及成像透明度受限。三維限制的典型例子包括在彎曲或有圖案的表面上培養(yǎng)細胞，一個扁平或受限的細胞結構，并以高合流的方式將ECM覆蓋在扁平的細胞單層上，這將使細胞向上拉，迫使更多的細胞-細胞相互作用采用3D細胞形態(tài)。膠原夾心中的肝細胞有足夠的接觸面積來獲得極性，并形成一個與體內(nèi)相同的周期收縮的膽管腔，沒有3D網(wǎng)絡，與天然組織相比更寬，膽汁淤積。這種基于細胞的模型能夠高分辨率地解剖膽管收縮的機制，并了解調節(jié)相變的分子機制。我們還可以設想更多基于crispr編輯細胞的工程類器官模型，用于疾病建模，盡管這些細胞和模型是合成的。

除了在創(chuàng)造更多生理相關、健壯和易于使用的類器官模型方面的技術進步外，我們還設想在應用中看到更大的影響。在過去的二十年里，雖然有關于取代動物實驗的討論，但這些努力還沒有導致具體的行動。然而，這種情況正在迅速改變，監(jiān)管機構現(xiàn)在在多個領域建立了硬性限制。類器官可以在體內(nèi)重現(xiàn)復雜的生理功能，這也增強了人們的信心，即新的替代方法現(xiàn)在是可行的選擇。將有更多的動物研究結果外推到人類類器官中，以更好地了解人類生物學和病理生理學。我們設想廣泛采用類器官作為細胞治療、再生醫(yī)學、體外診斷和藥物發(fā)現(xiàn)的細胞來源。


參考文獻：
Zhao, Z., Chen, X., Dowbaj, A.M. et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers 2, 94 (2022). https://doi.org/10.1038/s43586-022-00174-y

相關應用介紹

掃描關注微信公眾號，隨時了解更新信息！

掃描關注，隨時溝通。