【顯微課堂】冷凍電子斷層掃描

2025-02-20 17:38:37 67閱讀次數

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冷凍電子斷層掃描(CryoET)用于分辨細胞環境內的生物分子，分辨率達到前所未有的一納米以下。

冷凍電子斷層掃描(CryoET)用于分辨細胞環境內的生物分子，分辨率達到前所未有的亞納米級，為研究分子社會學開啟了一扇窗。在這一尺度下，僅通過形狀就可以識別各個蛋白質，而不需要任何標記。但是，亞納米分辨率下的成像伴隨著一個重大的挑戰：您需要找到并精準定位感興趣的部位。

提供先進的冷凍電子斷層掃描解決方案，使用冷凍光學顯微鏡進行快速、高分辨率的成像和精確的圖像數據傳輸，同時在整個工作流程中保持最佳的冷凍條件。

什么是冷凍電子斷層掃描？

使用冷凍電子斷層掃描（也稱為電子斷層掃描），可以在原生和功能狀態下以三維分子分辨率分析蛋白質間相互作用。樣本在一系列受控的位置上傾斜時，會成像為一系列的二維圖像。由此產生的圖像“切片”可以組合起來，生成樣本的三維重建圖像。

樣本的大小以及適用的觀察技術。

CryoET工作流程包含哪些步驟？

該技術涉及樣本的制備，樣本在電子顯微鏡載網上，然后迅速陷入液氮中冷凍，使樣本玻璃化，防止冰晶形成。

為了進行高分辨率的冷凍斷層掃描，成像的標本切片厚度不應大于300納米。為了觀察樣本的“較厚”部分（如細胞體），必須將樣本減薄。除了冷凍超薄切片技術外，使用專門或多模態的冷凍掃描電子顯微鏡進行聚焦離子束(FIB)研磨是一種首選方法。兩個離子束窗口的定位應確保在感興趣區域內形成厚度大約200納米的薄冰片（薄片），以便進行冷凍電鏡電子斷層掃描。

現在可以用冷凍透射電子顯微鏡掃描制備的樣本，然后必須進行數據重建過程，將二維圖像重建為單一的三維模型。

Coral Cryo 3D冷凍電子斷層掃描工作流程解決方案

典型的CryoET工作流程中有哪些挑戰？

在典型的CryoET工作流程中，最大挑戰是難以確定包含要成像的細胞或蛋白質的精確感興趣區域。目標定位反復失敗會導致過程非常耗時，最終浪費昂貴的電子顯微鏡(EM)成像時間。工作流程中的另外兩個挑戰包括確保樣本質量和冰層厚度始終如一，以及在將樣本傳送到冷凍透射電鏡之前使樣本保持充分玻璃化。

LAS X Coral Cryo：基于插值的三維目標定位，在x和y方向對切片進行多層掃描(z-stack)。這些標記可在所有相關窗口中交互式移動。

如何用冷凍光學顯微鏡克服冷凍電子斷層掃描(CryoET)的挑戰？

冷凍光學顯微鏡可以在兩個重要方面對CryoET工作流程做出積極貢獻。

首先，光學顯微鏡有助于評估樣本的質量。使用冷凍光學顯微鏡可以快速了解樣本的冷凍質量和冰層厚度，以及樣本的分布是否適合進一步處理。徠卡的冷凍解決方案可確保樣本在這些步驟中保持安全和活性。

其次，在提高工作流程效率方面，冷凍光學顯微鏡的最大潛力是能夠在啟動時間和成本密集型的冷凍電鏡制備工作之前，更加精準地定位感興趣的結構。徠卡的冷凍光學顯微鏡解決方案能夠將目標結構的圖像和坐標輸出到后續的電鏡步驟，從而顯著縮短電鏡成像時間。

一個完整載網的焦面總覽，有不同的模式來識別載網缺陷、對齊標志和目標分布。HeLa細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室Mahamid團隊的Ievgeniia Zagoriy提供。藍色–Hoechst，細胞核；綠色–MitoTracker Green，線粒體；紅色–Crimson熒光珠和Bodipy，脂滴。一個載網方格的邊緣長度：90微米，比例尺寬度：35微米。完整載網直徑：3毫米

Coral Cryo簡介：迄今更有效的CryoET工作流程

徠卡提供專用的三維冷凍電子斷層掃描工作流程解決方案，可確保樣本活性、進行質量檢查，最重要的是確保三維目標定位機制精準可靠，從而克服各種典型的挑戰。我們優化的硬件（包含冷凍臺和傳送梭）配合先進的CryoET目標定位軟件，以及適用于冷凍聚焦離子束(FIB)或真空冷凍傳送(VCT)載物臺的各種無縫集成和傳送選項。

萊茵衣藻，兩種不同類型的鞭毛內轉運蛋白IFT-NeonGreen和IFT-mCherry。樣本由德國德累斯頓馬克斯-普朗克分子細胞生物學與遺傳學研究所的Pigino實驗室提供。

實現精準的三維體目標定位

了解無縫銜接的冷凍電子斷層掃描工作流程Coral Cryo如何使用共聚焦超分辨率更精準定位您感興趣的結構。該工作流程可減少并優化工作流程的步驟，改善樣本的裝載和傳送，因此可提高CryoET工作流程的效率。

頂部掃描電鏡視圖（左圖）和聚焦離子束視圖（右圖）的超分辨率三維共聚焦疊加圖像。疊加是使用熒光珠作為相關性標志來執行的。HeLa細胞標記如下：細胞核由Hoechst標記，藍色；線粒體由MitoTracker Green標記，綠色；脂滴由Bodipy和Crimson熒光珠標記，紅色）。比例尺：20微米。細胞由德國海德堡歐洲分子生物學實驗室Mahamid團隊的Ievgeniia Zagoriy提供，掃描電鏡/聚焦離子束圖像由該團隊的Herman Fung提供。