類器官是現在最 熱門的體外細胞模型，其的培養方式脫離之前常用的2D模式，讓細胞可以在和地球生命體一樣的3D環境下成長，讓生長的維度不再局限在XY軸，還可以向Z生長從而出現類似于組織和器官的結構，正是這種維度的擴展，讓3D培養出來的細胞團可以表現出和體內組織和器官更類似的生理學結構和功能，故稱為類器官技術。

其細胞的來源是上皮成體干細胞和腫瘤細胞這樣的能自我更新的細胞，用前者培養因為其具有分化能力還能進行分化。但是這兩種細胞都需要通過活體實驗獲取，雖然全能的胚胎干細胞可以通過分化可以形成各種細胞包括了各種成體干細胞，但是獲取難度同樣大而且倫理風險很大，因此誘導多能干細胞（iPSC）技術可以完 美解決該問題1，而講類器官技術和多能干細胞結合得最 具代表性的人物則是辛辛那提醫院的James M.Well教授。

在2017年他首 創從PSC培養出了消化道的類器官2。他的初衷是讓建立體外人類器官模型更加方便，畢竟一般實驗室是很難獲得人的手術樣本，同時也解決了手術獲取干細胞的時候純度的問題；此外，還可以通過精確的分化調控產生出不同的細胞，如可以在培養胃底類器官時候，加BMP4處理48小時可以長出胃壁細胞3；最 后，還因為iPSC保留了宿主的全部基因序列（含突變），所以可以模擬出各個組織因為遺傳因素可能出現病變。但是這樣培養出來的類器官也有其缺陷，因為畢竟還是在培養皿中進行培養，所以無法形成體內的環境，如神經系統的控制、循環系統對養分的更新，所以這些類器官在不傳代的情況下能培養時間一般在2周，最 長不過4周，而傳代就意味著類器官會被打散，因而造成其能生長的尺寸有限。

而James M. Wells教授為此做出了兩個解決方案。其一是使用器官芯片技術，在這種微流控芯片中進行培養，這樣可以通過芯片的腔室和外置蠕動泵來模擬出體內的循環，而且借助液流系統可以方便地控制加入藥物和各位微生物或病毒的濃度和時間，便于完成藥敏、藥代和感染實驗4。其二是將培養過的類器官植入在免疫缺陷小鼠的體內，讓其可以融合到小鼠的器官上，讓類器官可與宿主的神經系統和循環系統融合，不但可以讓其長得較之在培養皿中更大，可以達到近千倍，而在最 新文章中報道，這種植入的類器官在宿主體內開始發育出布倫納氏腺這樣有分泌功能的復雜結構，從而這種升級版的類器官為讓其往器官移植方面的應用建立了基礎5。

到這里，是不是大家對James M. Well教授的這套技術路線非常感興趣呢？但PSC實驗流程很長，對分化節點的把握至關重要，因為細胞的狀態瞬息萬變，如果涉及熒光染色和拍照可能會耽誤這些重要節點，從明場觀察到的活細胞的狀態下就進行后續實驗判斷非常重要，所以后續部分我們先就以胃類器官為例，將培養過程中涉及明場形態觀察的要點進行介紹。

下圖中的明場圖像主要來自Leica-Microsystems的S APO體視鏡，其擁有復消色差（APO）鏡頭，可以實現 8:1 變倍比以及高達 80x 的強大放大能力，此類鏡頭適用于可見光譜及更大范圍內最 高規格的應用，可以讓您方便觀察和拍攝干細胞培養過程和分化結果。

hPSC-胃類器官（GOs）培養過程中明場圖像解析3：

整個技術流程如圖1所示，圖1a中介紹了整個流程需要34天，可以從hPSC分化培養成胃竇類器官（hAGOs）和人胃底類器官（hFGOs）。而這2種類器官在前6天（即：Day0-5）處理方式一樣，都是分化成后段前腸球體（posterior foregut spheroids），然后包埋到基質膠中，進行后續的處理。而前6天的步驟中，第 一階段前3天需要加入Activin A和BMP4，讓hPSC分化成單層的定形的內胚層（DE），其的標記物是SOX17和FOXA2。而第二階段的3天需要添加Chiron、FGF4、Noggin和RA（第5天加入）形成3D懸浮的前腸球體，其的標記物是HNF1β和SOX2。

然后將懸浮的前腸球體包埋進基質膠中，如果要培養出hAGOs需要添加EGF、Noggin和RA先處理3天，接下來用添加EGF處理3周。如果是培養hFGOs，則是用EGF、CHIR、Noggin和 RA處理3天。在培養體系中，Noggin作為BMP信號通路的抑 制劑，可以啟動前腸球體的發育；RA讓前腸發育成后部前腸，后者的標記物是HNF1B和GATA4。在處理的3天中，經典wnt信號通路的激活可以讓GOs形成胃底上皮，CHIR這個小分子可以起到該作用。在Day 9，胃底球體在含有CHIR和EGF的培養基中培養，在Day 20加入FGF10直到流程結束。在Day 30的時候需要降低EGF的濃度，這樣可以增加hAGOs和hFGOs中內分泌細胞的數量。在Day 30 對hFGOs 進行48小時的BMP4和PD032591處理可以刺激其產生胃壁細胞。

圖1 培育和分化流程。 

圖2 第0-3天，觀察目標hPSC細胞的適當匯合度，以確保hPSC能分化為DE和穩定生成后部前腸球狀體。a. 細胞按不同比例進行單細胞傳代后1天，hPSC的第0天圖像，三組圖片分別展示了低、目標和過高的匯合度。a組上部分別是傳代后的hPSC在低倍放大的情況想下低的匯合度（左）、目標匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。而a組下部依次是低的匯合度（左）、目標匯合度（中）和過于密集的匯合度（右）。b. 第3天，在3天Activin A處理結束時，達到目標匯度的DE細胞單層的低倍（頂部）和高倍（中間和底部）圖像。c. 第6天預期的球狀體生成低倍圖像，生成結果為差（左）、旺盛（中間）和中等（右）。a,b. 在圖像采集前更換培養基以去除細胞碎片。比例尺，1mm（a,b（頂部和中心），c）；250 μm（b，底部）?！咀ⅲ阂驗橐ＷC各個圖像的亮度匹配，所以對a中頂部圖像的亮度進行了調整。】

圖3 第4-20天，后前腸球狀體生成、hAGOs和hFGOs在基質膠中生長相關的形態學變化。a. (上排)，第4天的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，整個孔中出現了可以形成球狀體的單層細胞，表現為3D出芽形態。（中排）第5天，可以形成球狀體的單層細胞的低倍（左）和高倍（右）放大圖像，因為3D形態形成了許多貼壁的出芽球狀體和一些自由漂浮的球狀體。（下排）第6天的低倍（左）和高倍（右），可以形成球狀體的單層細胞（其中有大量可以進行收集的自由漂浮球狀體），單層細胞基本上沒有3D出芽形態。b. 第6天，自由漂浮在培養基中的單個球狀體的高倍放大圖像。來自同一代的球狀體在形狀和大小上各不相同，但都被包被在基質膠中以備將來生長。c. 在基質膠中的胃竇和胃底球狀體在第9天（上排）、第13天（第二排）和第20天（第三排）長成hGO的低倍倍放大圖像。插圖顯示了基質膠中單個球狀體的放大圖像。（下排）第20天高倍放大的hAGO和hFGO圖像，有大量非計劃的神經生長（綠色箭頭）。在選擇hGO作進一步培養時，應避免選擇這種hGO，以減少密度。比例尺，1 mm（a,c），250μm（b）。白色方框內的插圖是5倍數字放大的圖像；插圖的寬度為~833μm（c）。【注：對c的上排圖像亮度進行了調整，以使其與其他圖像的亮度匹配。】

圖4 降低了EGF濃度后，在基質膠中生長的hGO中胃竇和胃壁細胞的狀態。白色箭頭指示hAGO發育出的內部腺體。黃色箭頭表示在hFGO中發育出外部腺體的出芽。綠色箭頭指示了一個在低EGF濃度下發育出來的神經叢。a,b,在Day 24（上排）、27（中排）和34（下排），在基質膠中生長的hAGO和hFGO的低倍（左）和高倍（右）放大圖像。a（下排），發育后的hAGO顯示有清晰的管腔和旺盛的內部腺體。b（下排），發育后的hFGOs顯示有旺盛的外部腺體出芽，腔內可能含有或不含有很多細胞碎片。比例尺，1 mm?！咀ⅲ簩ο屡艌D像的亮度進行了調整，以使其與其他圖像的亮度匹配?！?/span>

參考文獻：（上下滑動查看更多）

1. Kazutoshi Takahashi, Shinya Yamanaka. (2006). Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell 126, 663–676.

2. McCauley, H.A., and Wells, J.M. (2017). Pluripotent stem cell-derived organoids: using principles of developmental biology to grow human tissues in a dish. Development 144, 958–962.

3. Taylor R. Broda. Et al. (2018) Generation of human antral and fundic gastric organoids from pluripotent stem cells. Nature Protocol 14, pages28–50

4. Kang Kug Leea. Et al. (2018) Human stomach-on-a-chip with luminal flow and peristaltic-like motility. Lab Chip 18(20): 3079–3085.

5. Alexandra K. Eicher. Et al. (2022) Functional human gastrointestinal organoids can be engineered from three primary germ layers derived separately from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 29, 36–51