首先，團隊優化了新的培養基 M1 / M2。作為培養基優化的起點，團隊使用高級 DMEM / F12 培養基，補充谷氨酰胺、伯莫辛、N- 乙酰半胱氨酸和 B27 補充劑，形成基礎培養基。然后，評估了成纖維細胞生長因子 FGF-10、p38 抑制劑 SB202190、TGF-b 受體抑制劑 A83-01、EGF、FGF-2 或 Noggin 等對類器官形成的影響^[2]，Z終選擇繼續使用基礎培養基，補充  FGF-10、SB202190 和 A83-10 進一步優化形成培養基 M0.1。

培養基 M0.1 可以促進類器官的生長，但不能維持傳代的生長。因此，團隊著手將培養基進一步優化。發現添加 FGF-4 導致傳代過程中類器官形成增加，形成培養基 M0.2。接下來，在 M0.2 中補充 b- 雌二醇增加了 HGSC 類器官的形成和傳代生長，形成培養基 M0.3。在接下來的實驗中，添加煙酰胺進一步改善了類器官的形成^[3]。經過對煙酰胺濃度的摸索，團隊在Z終的 HGSC 類器官培養基配方中加入了 5 mM 煙酰胺，形成培養基 M1。在培養基 M1 中添加 EGF、Heregulinβ-1、氫化可的松和佛司可林，形成培養基 M2。M2 可以促進或限制類器官生長，但具體取決于樣品。因此，為了Z大限度地提高類器官成功生長的可能性，每個 HGSC 樣品應在兩種不同的培養基 M1  和 M2 中平行培養。

團隊發現，使用 M1 / M2 的類器官培養方法可得到比以前發表的方案更高的 HGSC 類器官培養成功率（圖2）。

利用 M1 / M2 培養基，團隊總共開發了 17 種穩定的  HGSC 類器官培養物，其中通過 M1 培養的有 7 種， M2 培養的有 10 種。達到持續擴增階段所需的時間因類器官培養物的不同而不同，從 26 天到 18 天不等，平均為 89 天。所有類器官培養物均被冷凍保存，并在復蘇后恢復生長。值得注意的是，HGSC 類器官在不同患者間和同一患者來源的培養中表現出形態異質性。比如，EOC677_pAsc 類器官生長為小而密集的聚集體，而同一患者 EOC677_rAsc 和EOC677_r2Asc 形成松散聚集的囊性結構。其他觀察到的結構包括球狀聚集體（EOC172_rAsc 或 EOC733_iOme）或大的、不規則的、密集的聚集體（EOC733_pPer、EOC1120_pOme 或EOC1120_rAsc）。為了將類器官的內部表型與相應患者樣本的內部表型進行比較，進行了蘇木精伊紅和  IHC 染色。總體而言，類器官表現出匹配腫瘤上皮的形態學特征，包括腺狀生長和嚴重核多形性。IHC 標記物的表達也一致，并且顯示出更均勻的染色強度和更高的標志物陽性細胞百分比。

HGSC 類器官在長期培養中保留了患者樣本的基因組特征和轉錄組特征。團隊進行了 WGS 分析，以研究類器官是否概括了原始患者腫瘤的基因組圖譜。類器官表現出與原始患者樣本非常高的突變一致性。又進行了拷貝數變異（CNV）分析，得出類器官在長期傳代中保持原始腫瘤的 CNV 譜（圖3）。總體而言，目前的類器官概括了患者間基因組異質性，并準確地反映了疾病的演變。為了弄清楚穩定、長期的 HGSC 類器官培養物在單細胞水平的轉錄特征是否可以代表患者腫瘤，團隊對來自 5 名患者的類器官樣本進行了  scRNA-seq （圖3）。幾乎所有來自類器官的細胞都被歸類為癌細胞。這些數據表明類器官在單細胞水平上與原始腫瘤樣本在轉錄上高度相似，與類器官的基因組表征一致。

Z后，團隊對 11 種類器官培養物進行了藥物反應分析，以研究類器官藥物反應是否與先前在臨床患者中觀察到的藥物反應相關。為了高通量進行實驗，團隊將懸浮在基底膜提取物中的類器官片段接種到超低附著的 384 孔微孔板中，并用適合樣品的生長培養基覆蓋培養物（圖4）。細胞培養條件包括葡萄糖、谷氨酰胺和其他營養素的非生理濃度，可以極大地影響功能測定中的藥物反應^[4,5]。為了探索培養條件是否會影響類器官藥物反應與臨床反應之間的相關性，團隊在類器官生長的初始階段后將生長培養基更換為一半的種子板中的生理性人血漿樣培養基 HPLM。HPLM 模擬人血漿的代謝組成，為評估藥物反應提供了更具生理相關性的環境^[6]。

團隊將生長培養基和 HPLM 培養基中的類器官暴露于一組用于 HGSC 臨床治療的藥物，通過死細胞熒光染色和高通量共聚焦成像評估了細胞毒性（圖5）。藥物作用后，類器官中的細胞核用 Hoechst 33342（藍色，細胞核）染色，死細胞用細胞毒素綠（綠色）染色。使用高內涵對類器官進行成像，并使用圖像分析軟件估計死細胞百分比。

HGSC 類器官藥物反應與臨床結果的相關性取決于培養基，建議進一步研究使用基于類器官的測定和生理樣培養基來預測臨床結果。高內涵成像技術在類器官藥物篩選和優化培養基條件中，由于其成像及分析的通量優勢，節省了大量人力和時間，為轉化醫學研究提供了新的思路和方法。

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