創新2024 | 洞悉生命奧秘類器官成像詳解（方案和試劑篇）

2024-07-23 17:15:13 48閱讀次數

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在神經生物學，干細胞研究，再生醫學和癌癥生物學中，類器官和球狀體模型的使用頻率越來越高。這些3D模型內的細胞相互作用、細胞分裂、形態學，以及基因和蛋白表達等方面更接近體內真實情況，更準確地模擬了細胞的自然環境，進而實驗結果的生理相關性更高。2D和3D細胞模型的對比請見下表：

表1. 2D和3D細胞模型的對比

3D培養的細胞、類器官和球狀體需要特殊樣品處理和染色方法，才能使用熒光顯微鏡進行觀察。相對于2D培養的細胞來說，3D培養細胞有一定厚度，導致光無法有效透過。使用成像法觀察固定3D細胞模型（包括類器官和球狀體）時，建議使用透明化試劑處理樣品，以獲得清晰明亮的熒光圖像。

圖1. 透明化處理可顯著改進球狀體熒光染色結果（A549球狀體）。

細胞核：Hoechst，藍色，貨號H21486；增殖：AF488-EdU，綠色，貨號C10337；AF647-Ki67，紫紅色。

試劑和耗材

圖 2. HeLa 球狀體缺氧內核檢測。

缺氧：Image-iT 缺氧檢測試劑（紅色，貨號H10498）；復染：NucBlue Live ReadyProbes 試劑（藍色，貨號R37605）。

實驗步驟

小貼士

我們建議您減掉移液管尖端、擴大開口，以保護球狀體結構。
本方案建議用于厚度在500微米以內的球狀體。
閱讀熒光染料和試劑的說明書：并非所有的染料和試劑都可以固定，許多染料和試劑需要在固定前使用。
我們強烈建議您在使用透明化試劑盒之前優化好一抗濃度：用梯度稀釋的抗體染色陽性和陰性對照樣品，稀釋倍數包括1:10、1:100、1:500、1:1000；較厚的球狀體可能需要更多的抗體。

球狀體固定和透明化

（上下滑動，查看3D成像詳細實驗步驟）

球狀體可以在組織培養板內直接固定，或轉移到離心管中進行固定。

500 g離心樣品5 分鐘。輕輕去除培養基。
用冷 PBS 清洗樣品一次。500g離心5分鐘，除去上清液。
（可選）固定前加入細胞活力檢測試劑（具體方案請見下文）。我們建議使用 LIVE/DEAD 可固定染料進行活力染色。
加入 4% 多聚甲醛，體積約為組織體積的 10 倍。確保組織浸沒在固定劑中。室溫固定 1 小時，保持輕柔震蕩。
用冷 PBS 清洗樣品一次。500 g 離心 5 分鐘，除去上清液。
室溫透明化球狀體 15 分鐘，保持輕柔震蕩。推薦的透明化試劑包括CytoVista 抗體滲透緩沖液。
500g 離心 5 分鐘，除去上清液。
用含 1% 胎牛血清的 PBS 清洗樣品兩次。
500g 離心 5 分鐘。除去上清液。
用封閉緩沖液（例如 CytoVista 封閉緩沖液）在 37 ℃ 下封閉樣品 2 小時，保持輕柔震蕩。

標記

小貼士

滴定一抗濃度以獲得最佳結果：一抗過多或過少都會導致標記效果欠佳或無標記；抗體濃度可能需要根據組織的厚度而變化。
抗體孵育條件可能需要根據具體樣品和實驗進行優化。

加入在 CytoVista 抗體稀釋緩沖液中制備的一抗。
室溫孵育樣品過夜，保持輕柔震蕩。
用 CytoVista 清洗緩沖液清洗樣品 3 次，以去除未結合的抗體。500 g 離心 5 分鐘，除去上清液。
加入在 CytoVista 抗體稀釋緩沖液中制備的二抗。
注意：建議進行抗體滴定以找到最佳濃度。
室溫孵育樣品過夜，保持輕柔震蕩。
每 mL 樣品添加 1 滴NucBlue 復染劑；或加入DAPI復染劑，工作濃度 300 nM。
室溫孵育樣品 30 分鐘，保持輕柔震蕩。
500g 離心 5 分鐘，除去上清液。
用 CytoVista 清洗緩沖液清洗樣品 3 次。500 g 離心 5 分鐘，除去上清液。

封片

可以將 SlowFade 封片劑加到成像玻璃皿中的樣品上。也可以把球狀體轉移到蓋玻片，在球狀體上滴加1~3滴 SlowFade 封片劑，最后將蓋玻片放在載玻片進行成像。

小貼士

在使用前，請確保 SlowFade 抗淬滅封片劑升溫至室溫。如果試劑是冷凍儲存的，請在室溫下解凍 1 小時。請勿搖動試劑瓶，以防產生氣泡。

成像

我們建議使用有 Z stack 功能的顯微鏡，例如 Invitrogen EVOS M5000、EVOS M7000 或 CellInsight CX7 高內涵平臺。Celleste 6 圖像分析軟件具有 2D/3D 去卷積功能，可助您獲得更清晰的圖像。

圖3. CellInsight? CX7 LZR Pro 高內涵篩選平臺

類器官功能檢測常用試劑

細胞活力檢測

推薦使用 LIVE/DEAD 活力/細胞毒性試劑盒（貨號 L3224）。固定前進行下列步驟。

將 5 μL 組分 A 和 20 μL 組分 B加到 10 mL DPBS 中，以制備染色溶液。
將 100–200 μL 染色溶液直接添加到細胞中。
室溫避光孵育 2 小時，保持輕柔震蕩。

活球狀體細胞活性氧 (ROS) 檢測

推薦使用 CellROX Green 試劑（貨號 C10444）在固定前進行活性氧檢測。只有 CellROX Green 和 Deep Red 可以固定和透化。

小貼士：使用100 μM 甲萘醌處理后的球狀體作為陽性對照。

將 CellROX Green 染料添加到培養基中，終濃度為 5 μM（例如，每 500 μl 培養基添加 1 μl）。
室溫避光孵育 2 小時，保持輕柔震蕩。
用 PBS 清洗。500 g 離心 5 分鐘。輕輕除去上清液。重復 3 次。
固定。后續可進行抗體染色和 NucBlue Live ReadyProbes 試劑（貨號 R37605）復染。

圖4. 檢測藥物處理的 HeLa 球狀體中的細胞活力和氧化應激。

A–C：在使用Live/Dead細胞成像試劑盒（貨號R37601）檢測的球狀體中，活細胞發出綠色熒光，死細胞發出紅色熒光。D–F：在用 CellROX Deep Red 試劑（貨號C10422）和 NucBlue Live ReadyProbes 試劑（貨號R37605）染色的球狀體中，氧化應激的細胞發出紅色熒光，而活細胞細胞核發出藍色熒光。

細胞凋亡檢測

注意：固定前進行下列操作。僅 CellEvent Caspase 3/7 Green 和 Red可固定。

在樣品中加入CellEvent Caspase 3/7 檢測試劑，終濃度2 μM；每 mL 樣品中加 1 滴 NucBlue進行細胞核復染。
室溫避光孵育 2 小時，保持輕柔震蕩。
用 PBS 清洗。500 g 離心 5 分鐘。輕輕除去上清液。
固定等后續操作。

圖5. 乳腺癌球狀體中的 NK 細胞 ADCC 檢測（抗體介導細胞毒性實驗）。

細胞示蹤：CellTracker Deep Red，紫紅色，貨號 C34565；凋亡：CellEvent Caspase 3/7 Green，綠色，貨號C10423；細胞核：NucBlue Live，藍色，貨號R37605。

細胞增殖檢測

（上下滑動，查看3D成像詳細實驗步驟）

注意：在細胞培養時進行下列操作。

優化細胞培養條件，確保球狀體在生長階段。在細胞周期S 期加入Click-iT Plus EdU 細胞增殖試劑。
將 2 mL 組分 C （DMSO）或等體積水性溶劑加到組分 A 中，制成 10 mM EdU 母液。–20 ℃ 保存。
將組分 D 瓶中的溶液 (4 mL) 轉移至 36 mL 去離子水中，制備 1X Click-iT EdU 反應緩沖液。2–8 ℃ 保存。
將 2 mL 去離子水添加到組分 F 中并混合直至完全溶解，制成 10X Click-iT EdU 緩沖添加劑。–20 ℃ 保存。
用含 20 μM EdU 的新鮮培養基 37 ℃ 培養細胞過夜。增殖細胞將在此階段把 EdU 加到DNA中。
固定細胞后進行 EdU 檢測和DNA染色。詳細步驟請見Click-iT Plus EdU 細胞增殖試劑盒說明書。

參考文獻：

1. Badr-Eldin, Shaimaa M., et al. “Three-Dimensional in Vitro Cell Culture Models for Efficient Drug Discovery: Progress so Far and Future Prospects.” Pharmaceuticals, vol. 15, no. 8, 27 July 2022, p. 926, https://doi.org/10.3390/ph15080926. Accessed 14 Oct. 2022.

2. Sherman H, Gitschier HJ, Rossi AE. A Novel Three-Dimensional Immune Oncology Model for High-Throughput Testing of Tumoricidal Activity. Front Immunol. 2018;9:857. Published 2018 Apr 23. PMID: 29740450

3. Mittler F, Obe?d P, Rulina AV, Haguet V, Gidrol X, Balakirev MY. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Front Oncol. 2017;7:293. Published 2017 Dec 11. PMID: 29322028

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