小鼠小腸類器官構(gòu)建寶典

來源：翌圣生物科技(上海)股份有限公司      分類： 2023-11-10 00:00:00 20閱讀次數(shù)

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類器官（organoids）是指利用干細(xì)胞、祖細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等在體外培養(yǎng)出的3D細(xì)胞培養(yǎng)物并具有一定的空間結(jié)構(gòu)組織類似物。2021年，類器官技術(shù)被列為“十四五”國家重點研發(fā)專項，作為疾病模型，相比于傳統(tǒng)2D疾病模型，類器官在闡明疾病的發(fā)展、穩(wěn)態(tài)性和發(fā)病機理等與體內(nèi)環(huán)境更加接近，在多領(lǐng)域?qū)l(fā)揮重要，諸如細(xì)胞治療、藥物研發(fā)、基因工程、免疫研究、組織再生等領(lǐng)域。

 

以下內(nèi)容小翌將通過講述小鼠小腸類器官培養(yǎng)的全過程及相關(guān)注意事項為大家在培養(yǎng)過程中減少踩坑概率。

 

 

實驗步驟

 

 

實驗所需材料

 

 

 

應(yīng)用方向	材料名稱	貨號	規(guī)格
腸組織消化	Cebrary®Tissue Digestion Solution 組織消化液	41423	30ml
	70um 細(xì)胞篩網(wǎng)	542070	70um
耗材設(shè)備	培養(yǎng)皿	84003	100mm
	離心管	83503/83505	1.5ml&15ml
	移液管	84503	5ml
類器官培養(yǎng)支持	Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	40191	5 mL
培養(yǎng)基成分及添加劑	DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基	41420	500ml
	DPBS	41403	500ml
	EDTA	60126	100g
	BSA	36100	25g
	Recombinant Human RSPO1 Protein	92278	100ug
	Recombinant Human Noggin Protein, His Tag	92528	100ug
	Recombinant Human EGF Protein	92708	100ug
	Recombinant Human Wnt -3a protein	92276	100ug
	NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)	50303	1g
	HEPES	60117	100ml
	L-alanyl-L-glutamine solution,200mM	60701	100ml
	B-27 supplement without Vitamin A,serum free,50X	60704	10ml
	N-2 supplement,serum free,100X	60706	5ml
類器官收集	Cebrary®Cell recovery solution for Organoid類器官回收液	41421	30mL
類器官凍存	Cebrary®Cell freezing medium for Organoid 類器官凍存液	41422	30mL

 

 

小腸類器官培養(yǎng)步驟

 

 

 

01

 

樣本制備：小鼠斷頸處死，表面噴灑酒精殺菌。在無菌環(huán)境下截取出近胃端處3~15cm腸組織，用鑷子小心去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預(yù)冷的含1%雙抗的DPBS溶液中。 

02

 

樣本清洗：使用注射器沖洗腸道2-3次，用手術(shù)剪將腸管小心剪開，腸腔面朝上，手使用手術(shù)刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后（呈現(xiàn)組織透明），將腸組織置于新的含 DPBS 的培養(yǎng)皿中清洗2~3次。

03

 

樣本初處理：將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬大小塊狀體，順勢轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中，用DPBS輕柔清洗3-5次，除去腸絨毛細(xì)胞和漂浮脂肪組織。

04

 

樣本消化：在清洗好的小腸碎片組織加入10-15ml含有3-5mM EDTA的預(yù)冷 DPBS 中消化，4℃孵育 30min左右，期間每10min輕搖一次離心管。

05

 

消化完成后，棄去EDTA消化液上清，用新的DPBS緩沖液將組織輕柔漂洗2~3次以去除剩余的EDTA。

06

 

在小腸組織碎片中加入10~15ml預(yù)冷的含0.1%BSA的DPBS，反復(fù)吹打、重懸組織碎片，使隱窩與基底層分離，然后取少許懸液鏡檢，當(dāng)看有大量隱窩樣結(jié)構(gòu)后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液使用70μm濾網(wǎng)過濾并收集穿過濾網(wǎng)的組織懸液。

07

 

重復(fù)步驟5-6兩次，1500rpm、4℃離心 3min。

08

 

混合物形成：用Ceturegel^®基質(zhì)膠重懸隱窩組織沉淀，每10μL基質(zhì)膠懸液包含200~600個隱窩，重懸后混合液置于冰上，盡快操作以避免基質(zhì)膠形成凝膠。

 

注意：基質(zhì)膠稀釋比例≥50%以保證培養(yǎng)過程中Ceturegel^®基質(zhì)膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

09

 

將混合懸液種植于24孔板底部正中央，每孔30~50μL左右，避免懸液接觸孔板側(cè)壁。

10

 

將種植后的培養(yǎng)板至于37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育30min左右待基質(zhì)膠凝固。

11

 

待Ceturegel^®基質(zhì)膠完全凝固后，沿壁緩慢加入已配制好的腸類器官培養(yǎng)基，每孔 800μL/孔。

12

 

將 24 孔板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3天更換一次新鮮培養(yǎng)基并監(jiān)測類器官生長狀態(tài)，一般小鼠小腸類器官在5~7天內(nèi)形成。

 

 

實驗結(jié)果

 

 

圖.小鼠小腸類器官體外培養(yǎng)結(jié)果圖

 

 

小腸類器官的傳代

 

 

培養(yǎng)5~7d或小腸類器官中央變黑時可進(jìn)行傳代，提前將24或12孔板放于培養(yǎng)箱中孵育至少30min。吸走待傳代的培養(yǎng)液，加1mL/孔冷的DPBS，1min后挑起基質(zhì)膠，用1mL槍頭將基質(zhì)膠輕輕吹散，用注射器一次性吸走懸液，重復(fù)操作1次，將懸液加入5mL離心管中，1200r/min，4℃、5min離心，棄上清，按每孔1∶3傳代。

 

 

小腸類器官的凍存

 

 

選擇生長狀態(tài)旺盛的類器官(一般傳代后3~4d)，進(jìn)行凍存，每兩孔凍存一管。吸去培養(yǎng)液，加入1mL細(xì)胞凍存培養(yǎng)液，用槍頭將加入類器官回收液的基質(zhì)膠吹散，后將懸液加到細(xì)胞凍存管中，放于凍存盒中，于-80℃冰箱放置1d，后轉(zhuǎn)入液氮長期保存。

 

 

小腸類器官的復(fù)蘇

 

 

將24孔板放于培養(yǎng)箱預(yù)熱30min。取出液氮中的凍存管并置于37℃水浴鍋中，當(dāng)凍存液溶解時取出，用1mL注射器抽吸一次，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，1200r/min、4℃，離心5min，棄上清，加入5mL冰DPBS重懸，重復(fù)上述離心步驟，棄上清。按照類器官培養(yǎng)的步驟鋪板和培養(yǎng)。

 

 

 

問題解析

 

Q

 

A

消化組織選擇什么消化液，消化時長是多少？

組織的消化液可以選用EDTA或膠原酶，如果消化空腔性器官EDTA適合，如小腸和胃；膠原酶有不同類型，消化的組織類型比較廣泛，可以搭配DNA酶一起。不同組織消化時間差異比較大，從十幾分鐘到數(shù)小時。

Q

 

A

不同孔板培養(yǎng)類器官培養(yǎng)所需的基質(zhì)膠和培養(yǎng)基體積?

培養(yǎng)類器官常用的是24孔板培養(yǎng)，按50μl/孔形成膠滴，再加入500μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；96孔板按10μl/孔形成膠滴，再加入200μl培養(yǎng)基覆蓋膠滴；6孔板每孔可以種植多個50μl膠滴，加入2~3ml培養(yǎng)基覆蓋膠滴。

 

 

 

其他相關(guān)產(chǎn)品

 

 

類型	貨號	產(chǎn)品名稱	應(yīng)用方向
即用型 3-6 mg/ml	40182	Ceturegel®  Matrix Ready-to-use，LDEV-Free基質(zhì)膠	適應(yīng)于細(xì)胞培養(yǎng)、貼壁、侵襲和遷移實驗以及細(xì)胞分化等研究
基本濃度 8-12 mg/ml	40183	Ceturegel® Matrix LDEV-Free基質(zhì)膠	適應(yīng)于2D和3D培養(yǎng)、侵襲和遷移實驗，也可以用于體內(nèi)成瘤實驗
	40184	Ceturegel® Matrix Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要應(yīng)用于需要顏色檢測如熒光檢測實驗等
高濃度 ≥18mg/ml	40187	Ceturegel® Matrix High Concentration，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要應(yīng)用于如血管生成、凝膠栓塞和體內(nèi)成瘤實驗（對于血管生成建議基質(zhì)膠終濃度要≥10mg/ml）
	40189	Ceturegel® Matrix High Concentration，GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠
	40188	Ceturegel® Matrix High Concentration，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠
低生長因子	40185	Ceturegel® Matrix GFR，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要是排除生長因子對實驗的干擾。應(yīng)用于與生長因子、信號通路等相關(guān)研究。無酚紅的也用來做類器官培養(yǎng)
	40186	Ceturegel® Matrix GFR，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠
干細(xì)胞用	40190	Ceturegel® Matrix hESC-Qualified，LDEV-Free 基質(zhì)膠	主要用于如hESC，iPSC等干細(xì)胞培養(yǎng)
類器官用	40191	Ceturegel® Matrix for Organoid culture，Phenol Red-Free，LDEV-Free 基質(zhì)膠	類器官培養(yǎng)專用基質(zhì)膠
鼠尾膠原	40125	Collagen, Type I , from rat tail 鼠尾膠原蛋白I（大鼠源）	侵襲和遷移。培養(yǎng)或分化研究
	40136	Cebrary® Collagen, Type I , from mouse tail 鼠尾膠原蛋白I型（小鼠源）	侵襲和遷移。培養(yǎng)或分化研究

 

 

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